人羊膜上皮細(xì)胞對(duì)于生長(zhǎng)因子和ORFV的敏感性研究

于永忠，王歡，譚強(qiáng)，趙文博，崔玉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶163319）

人羊膜上皮細(xì)胞（Human amniotic epithelial cell，hAEC）位于羊膜的最內(nèi)層，此類細(xì)胞擁有干細(xì)胞特性，在一定條件下可以向內(nèi)胚層（如肝細(xì)胞）、中胚層（如心肌細(xì)胞）和外胚層（如神經(jīng)細(xì)胞）等3種胚層細(xì)胞分化[1]。hAEC在治療中樞神經(jīng)障礙方面具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值，1996年，Sakuragawa等[2]最先發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的hAEC表達(dá)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志。隨后的研究表明，培養(yǎng)的hAEC能合成和釋放神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿，兒茶酚胺和多巴胺。hAEC移植治療大鼠帕金森?。≒D）的實(shí)驗(yàn)表明其在體內(nèi)不僅能存活并表達(dá)絡(luò)氨酸羥化酶（TH）活性，而且可以逆轉(zhuǎn)病情和防止神經(jīng)元死亡。hAEC對(duì)于靈長(zhǎng)類的脊髓損傷同樣具有良好的治療效果。目前hAEC已應(yīng)用于溶酶體蓄積病、神經(jīng)細(xì)胞退行性病變以及眼科疾病的治療。hAEC已被證實(shí)具有肝細(xì)胞的某些特性和功能。Takashima等[3]在hAEC進(jìn)行原代培養(yǎng)鑒定過(guò)程中，采用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和地塞米松等為誘導(dǎo)劑處理方法，使得hAEC逐步具備了分化為成熟肝細(xì)胞的潛能。

“羊口瘡”（ORF）是由羊傳染性膿皰皮炎病毒（ORFV）引起的一種急性、接觸性的動(dòng)物傳染病[4]，主要危害羊的口唇、蹄和外陰等部位皮膚，尤其是黏膜皮膚邊緣及分泌性粘膜，導(dǎo)致以紅斑、丘疹、水皰、膿皰和疣狀痂皮為特征的病變過(guò)程。該病在破壞強(qiáng)度上雖然僅造成皮膚或黏膜局部增生性損傷，甚至沒(méi)有系統(tǒng)性感染癥狀，但病毒能夠伺機(jī)長(zhǎng)期潛伏于宿主皮膚內(nèi)并演變?yōu)槌掷m(xù)感染和繼發(fā)感染。同時(shí)，ORFV也能感染人類[5-6]。由于ORFV只感染上皮細(xì)胞，病毒對(duì)于hAEC是否敏感有待于進(jìn)一步明確。實(shí)驗(yàn)以hAEC為對(duì)象進(jìn)行適宜的原代培養(yǎng)，同時(shí)應(yīng)用不同生長(zhǎng)因子刺激和ORFV感染觀察hAEC細(xì)胞敏感性，旨在研究ORFV與細(xì)胞相互作用特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Ⅳ型膠原酶（美國(guó)Gibco公司）；DMEM高糖培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（JRH，Bioscience）（美國(guó)Gibco公司）；0.25%胰蛋白酶-EDTA（美國(guó)Amresco公司）；10×青-鏈霉素溶液（美國(guó)Gibco公司）；人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（美國(guó)Gibco公司）；人重組表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）（美國(guó)Gibco公司）；ORFV毒株（OV/HLJ/04）由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 hAEC的制備及原代培養(yǎng)

健康的人羊膜（試驗(yàn)材料），來(lái)源于HIV、甲肝、乙肝及梅毒等病原物生物血清學(xué)反應(yīng)陰性的產(chǎn)婦胎盤（經(jīng)家屬同意）。用預(yù)先消毒的彎頭鑷子先將羊膜與絨毛膜進(jìn)行輕微鈍性剝離，然后將羊膜放置于含雙抗（青霉素100 U·mL-1、鏈霉素100μg·mL-1）的無(wú)菌PBS中沖洗數(shù)遍。再將漂洗后的羊膜用預(yù)先消毒的眼科剪剪成約1 mm×1 mm的組織塊，隨后加入0.2%的膠原酶Ⅳ于37℃下消化2.5 h；之后加入適量PBS稀釋后1 000 r·min-1離心3～5 min，輕輕吸出膠原酶消化液；向沉淀中加入0.25%的胰蛋白酶消化液，37℃振蕩消化30～50 min，消化后加入含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化；最后使用400目篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，棄掉雜質(zhì)，將濾液1 000 r·min-1離心5min，收集其中的上皮細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。hAEC原代培養(yǎng)、傳代具體方法如下：將要培養(yǎng)的上皮細(xì)胞利用不同成分的培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整為1×105個(gè)·mL-1的密度，種植于10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2 d換液1次。待細(xì)胞鋪滿90%板底時(shí)，用預(yù)溫的0.25%的胰蛋白酶37℃消化細(xì)胞2～3 min，待消化細(xì)胞大部分分離甚至脫落，用無(wú)菌PBS終止消化。收集消化好的細(xì)胞，1 000 r·min-1離心3min，棄上清。加入新的培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，再分裝新的培養(yǎng)板，補(bǔ)充培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。利用倒置顯微鏡逐日觀察不同細(xì)胞培養(yǎng)液中hAEC形態(tài)、生長(zhǎng)和增殖情況，以確定最適宜hAEC原代培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.2 hAEC在EGF和bFGF環(huán)境下生長(zhǎng)的差異性

hAEC在EGF和bFGF環(huán)境下能夠加快生長(zhǎng)速度。在培養(yǎng)基中，分別添加適量的EGF和bFGF，并已基本培養(yǎng)基作為對(duì)照，驗(yàn)證兩種不同細(xì)胞因子對(duì)于hAEC生長(zhǎng)影響的差異性。hAEC培養(yǎng)液配制：將10 cm培養(yǎng)板分3組：組1，培養(yǎng)液內(nèi)添加90%DMEM、10%胎牛血清、40 ng·mL-1的EGF；組2，培養(yǎng)液為90%DMEM、10%胎牛血清、10 ng·mL-1bFGF；組3，對(duì)照組，培養(yǎng)液為90%DMEM、10%胎牛血清。具體如表1所示。

表1 hAEC培養(yǎng)基不同組分Table1 Medium with different components for hAEC

1.2.3 hAEC生長(zhǎng)曲線測(cè)定

原代細(xì)胞培養(yǎng)傳代穩(wěn)定后，取傳代hAEC單細(xì)胞懸液（1×105個(gè)·mL-1）均勻接種于7塊96孔板中，每塊板設(shè)置3組，每組接種5個(gè)小孔 ，培養(yǎng)基使用量為每孔200μL，然后放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；從接種細(xì)胞的第2 d起每天取一塊板檢測(cè)，檢測(cè)前加入4mg·mL-1的MTT液（每孔50μL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后吸棄小孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO液（每孔150μL），再將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上震蕩約10 min，使結(jié)晶物溶解；利用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔檢測(cè)OD570nm值，計(jì)算各時(shí)相點(diǎn)吸光度的平均值，記錄結(jié)果。在繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線時(shí)，將橫坐標(biāo)設(shè)定為時(shí)間（d），縱坐標(biāo)設(shè)定為吸光度（表示細(xì)胞相對(duì)數(shù)量）OD570nm值。

1.2.4 hAEC的ORFV感染實(shí)驗(yàn)

將10-5TCID50的ORFV按照不同的稀釋濃度分別加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，未接毒的設(shè)為陰性對(duì)照。病毒稀釋比例為1∶1、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640等8個(gè)梯度。96孔板每孔加入病毒稀釋液10μL。接毒后，將細(xì)胞板放于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，做好細(xì)胞病變觀察記錄。

2 結(jié)果

2.1 hAEC的制備及原代培養(yǎng)結(jié)果

在倒置顯微鏡下可以觀察到，經(jīng)膠原酶IV和0.25%胰蛋白酶消化過(guò)的細(xì)胞大多數(shù)分散存在，偶爾能夠看到幾個(gè)細(xì)胞聚合在一起組成細(xì)胞團(tuán)塊。在原代細(xì)胞培養(yǎng)2～4 h后，可見大部分細(xì)胞開始貼壁。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞狀態(tài)趨于穩(wěn)定，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨向多角形（圖1所示）。最初細(xì)胞不好辨認(rèn)，有些細(xì)胞邊緣不清晰，胞體有些透明；當(dāng)培養(yǎng)接近10 d左右，細(xì)胞生長(zhǎng)一定數(shù)量，細(xì)胞變得致密，有層次感，在板底形成一定“紋理”。鋪滿板底70%～80%時(shí)可傳代。

圖1 hAEC原代培養(yǎng)結(jié)果（A：3 d；B：10 d）（500×）Fig.1 Primary culture of hAEC（day 3 to day 10）

2.2 不同的生長(zhǎng)因子對(duì)于hAEC生長(zhǎng)速度

將hAEC分別用不同成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)，結(jié)果表明，組1（A：培養(yǎng)24 h；B：培養(yǎng)48 h）培養(yǎng)液內(nèi)添加90%DMEM、10%胎牛血清、40 ng·mL-1的EGF，細(xì)胞生長(zhǎng)速度比對(duì)照組明顯加快；組2（C：培養(yǎng)24 h；D：培養(yǎng)48 h），培養(yǎng)液為90%DMEM、10%胎牛血清、10 ng·mL-1bFGF，細(xì)胞生長(zhǎng)速度比組1，細(xì)胞紋理清晰表明細(xì)胞相對(duì)致密，可以此作為生長(zhǎng)迅速的證據(jù)之一；組3（E：培養(yǎng)24 h；F：培養(yǎng)48 h）是對(duì)照組，培養(yǎng)液為90%DMEM、10%胎牛血清。結(jié)果說(shuō)明bFGF和EGF加速了hAEC的生長(zhǎng)，而未添加生長(zhǎng)因子的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。而且，添加組細(xì)胞培養(yǎng)3d就可以達(dá)到普通培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d的效果（圖2、表2所示）。

2.3 hAEC的生長(zhǎng)曲線

將第2代hAEC細(xì)胞通過(guò)MTT法，用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物的OD570nm值。根據(jù)OD570 nm值的大小計(jì)算反應(yīng)體系中細(xì)胞增殖程度。在第1～3 d細(xì)胞個(gè)數(shù)值逐漸上升，為生長(zhǎng)緩滯期。第4～7 d，細(xì)胞數(shù)目明顯的增加，為細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。第8～10 d，細(xì)胞的數(shù)目輕微增加，為平臺(tái)期。第15 d后，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，并伴有一定數(shù)量的細(xì)胞發(fā)生死亡。以細(xì)胞數(shù)×1 000為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，如圖3所示。

圖2 添加不同的生長(zhǎng)因子對(duì)于hAEC生長(zhǎng)速度的影響（500×）Fig.2 The influence of growth rate by various growth factor（bFDF，EGF）for hAEC

表2 不同組分培養(yǎng)基的hAEC生長(zhǎng)差異性Table2 Dissimilarity of hAEC growth under different components of themedium

圖3 hAEC的生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of hAEC incubated

2.4 病毒感染病變結(jié)果

在細(xì)胞接毒之后72 h內(nèi)，通過(guò)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）觀察，如圖4所示，正常細(xì)胞（A）接毒后，經(jīng)過(guò)24 h，細(xì)胞狀態(tài)變化很明顯。B代表細(xì)胞接毒24 h的狀態(tài)；C代表細(xì)胞接毒48 h的狀態(tài)；D代表細(xì)胞接毒72 h的狀態(tài)。其中，在48 h后發(fā)生病變。顯微鏡觀察到有部分細(xì)胞皺縮，細(xì)胞變圓，壞死，從培養(yǎng)板底部脫落等現(xiàn)象。結(jié)果表明，hAEC細(xì)胞對(duì)病毒ORFV存在敏感性，說(shuō)明ORFV對(duì)于hAEC有一定的侵染能力。

圖4 hAEC在ORFV感染后CPE結(jié)果Fig.4 The results of CPE of hAEC after infection by ORFV

3 討論

羊膜（Amnion）覆蓋于羊膜腔內(nèi)表面，其厚度為0.02～0.05 mm，是人體中最厚的基底膜。hAEC位于羊膜的最內(nèi)層，在受精后第8 d從外胚葉發(fā)育而來(lái)，使其可能維持原腸胚形成前期胚胎干細(xì)胞的可塑性。研究表明，hAEC在遺傳學(xué)上具備干細(xì)胞的某些特性[7]，因而很有希望成為干細(xì)胞移植的候選細(xì)胞。hAEC體外培養(yǎng)的難點(diǎn)是原代培養(yǎng)過(guò)程[8]中形成穩(wěn)定的細(xì)胞系，而原代培養(yǎng)的成功與否很大程度決定于能否獲得足夠數(shù)量活性強(qiáng)、品種純的上皮細(xì)胞。在研究中，我們采用多次消化法[9]獲得上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)借鑒了其他學(xué)者研究的經(jīng)驗(yàn)[10]，將兩種酶交替使用。首先用膠原酶IV處理羊膜組織，分解間質(zhì)組織等強(qiáng)韌成分，進(jìn)而獲得成片的上皮細(xì)胞，然后再用胰蛋白酶多次消化細(xì)胞，這樣得到的上皮細(xì)胞比較多，而且細(xì)胞的損傷小、完整性好、質(zhì)量高，細(xì)胞容易貼壁成活。實(shí)際上，表皮生長(zhǎng)因子（EGF）具有多種生物活性，能刺激hAEC分裂和增生；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）對(duì)來(lái)源于中胚層和外胚層的細(xì)胞具有很強(qiáng)的促分裂作用，而對(duì)于hAEC也有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。鏡下觀察hAEC對(duì)bFGF和EGF存在的應(yīng)激性，發(fā)現(xiàn)hAEC在bFGF的刺激下，細(xì)胞形態(tài)變化也較大，由原來(lái)的圓形變成梭形，可能與bFGF的促成纖維細(xì)胞增殖有關(guān)。而EGF對(duì)hAEC的刺激也反映出與EGF作用濃度有關(guān)，可能是因?yàn)椴煌瑵舛鹊腅GF啟動(dòng)的細(xì)胞分裂或分化信號(hào)通路不同所致。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明，在第15 d左右，細(xì)胞出現(xiàn)萎縮死亡跡象，可能是因?yàn)閔AEC缺乏端粒酶[11]。鑒于這兩種生長(zhǎng)因子在胚胎干細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞等的分化中獨(dú)特作用[12]，我們也將進(jìn)一步深入研究其中的機(jī)制。

ORFV主要引起上皮細(xì)胞病變，但與上皮細(xì)胞間存在復(fù)雜的作用關(guān)系，用RNAi技術(shù)可能實(shí)現(xiàn)針對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用[13]。hAEC在ORFV作用下病變明顯，可以提供病毒感染機(jī)制研究的細(xì)胞模型，對(duì)于探尋ORFV在感染非許可細(xì)胞的病變機(jī)制將起到積極的促進(jìn)作用。

[1]Miki T，Lehmann T，Cai H，et al.Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells[J].Stem Cells，2005，23（10）：1549-1559.

[2]Sakuragawa N，Misawa H，Ohsugi K，et al.Evidence for active acetylcholine metabolism in human amniotic epithelial cells：applicable to intracerebral allografting for neurologic disease[J].Neurosci Lett.1997，22（1）：53-56.

[3]Takashima S，Ise H，Zhao P，et al.Human amniotic epithelial cells possess hepatocyte-like characteristics and functions[J].Cell Struct Funct，2004，29（3）：73-84.

[4]Mercer AA，Haig DM.Parapoxviruses，the encyclopedia of virology[M].2nd ed.New York：Academic Press，1999.

[5]Brandt TA，Jacobs BL.Both carboxy-and amino-terminal domains of the vaccinia virus interferon resistance gene，E3L，are required for pathogenesis in amousemodel[J].JVirol.2001，75（2）：850-856.

[6]Robinson AJ，Ballassu TC，Contagious pustular dermatitis orf[J].Vet.Bull，1981，51：771-782.

[7]金玲，陳劍，吳靜，等.人羊膜上皮細(xì)胞的肝細(xì)胞特性[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（19）：732-738.

[8]劉小勇，陳劍，吳靜，等.人羊膜上皮細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)[J].廣東醫(yī)學(xué)，2007，28（2）：181-183.

[9]張春，車玉梅.應(yīng)用胰蛋白酶/DNA酶消化法分散人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，22（2）：232-241.

[10]方寧，宋秀軍，張路，等.人羊膜上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2009，32（2）：432-437.

[11]郭禮和.人羊膜上皮細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞和移植免疫耐受等優(yōu)良特性[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（4）：451-454.

[12]吳其全，張勝利，周君梅，等.胚胎干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的研究現(xiàn)狀[J].國(guó)際生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2009，22（2）：108-112.

[13]于永忠，郭雯，吳欣媛，等.靶向ORFV-DNA ploymerase基因shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，24（4）：38-41.