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    HBV-DNA含量與乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物的相關(guān)性研究

    2013-10-15 08:39:00賀巧鳳湖南省長(zhǎng)沙市三醫(yī)院檢驗(yàn)科410015
    關(guān)鍵詞:乙肝病毒乙型肝炎定量

    賀巧鳳(湖南省長(zhǎng)沙市三醫(yī)院檢驗(yàn)科 410015)

    乙型肝炎病毒(HBV)血清標(biāo)志物是臨床判斷患者病情和傳染性的重要依據(jù)之一。能夠反映狀態(tài)。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)逐漸應(yīng)用于臨床診斷和治療,它能夠直接檢測(cè)HBV-DNA的水平,反映HBV的感染活性。本文通過(guò)檢測(cè)乙型肝炎患者血清病毒標(biāo)志物和血清中病毒的含量,將結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析,探討二者的關(guān)系。

    1 資料與方法

    1.1 標(biāo)本來(lái)源 2009年1月至2011年12月在本院就診同時(shí)做乙型肝炎兩對(duì)半和乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)檢測(cè)的門診和住院的乙型肝炎感染者,共681例,其中男416例,女265例,年齡4~71歲。

    1.2 主要試劑 HBV-DNA定量診斷試劑由杭州博日科技有限公司提供。乙型肝炎(下稱乙肝)患者血清病毒標(biāo)志物測(cè)定用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),試劑由上??迫A生物工程公司提供。

    1.3 檢測(cè)方法 ELISA按試劑說(shuō)明書進(jìn)行,用Bio-Red酶標(biāo)儀測(cè)定和記錄結(jié)果;HBV-DNA載量檢測(cè)儀器采用美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的ABI7500熒光定量PCR檢測(cè)儀,操作嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。污染的控制標(biāo)本的處理、試劑的配制、上樣及PCR擴(kuò)增檢測(cè)嚴(yán)格分室進(jìn)行,每次檢測(cè)均設(shè)強(qiáng)陽(yáng)性、臨界陽(yáng)性、陰性、質(zhì)控試劑參照品。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    681例按乙肝病毒標(biāo)志物(HBV-M)常見(jiàn)模式分成10組,分別統(tǒng)計(jì)HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果。陽(yáng)性率和測(cè)定值均以大于103copy/mL為界限值。乙肝病毒e抗原(HBeAg)陽(yáng)性標(biāo)本(①,③組)HBV-DNA 陽(yáng)性率分別為94.9%和94.3%,與HBeAg陰性標(biāo)本組HBV-DNA陽(yáng)性率為0%~58.5%,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),具體結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 HBV-DNA及HBV-M結(jié)果比較

    3 討 論

    HBV感染的病原學(xué)診斷主要依靠免疫血清學(xué)方法檢測(cè)HBV血清學(xué)標(biāo)志物和分子生物學(xué)方法檢測(cè)HBV核酸。HBV血清學(xué)標(biāo)志物主要反映的是人體對(duì)乙肝病毒的免疫狀態(tài),而HBV-DNA是病毒復(fù)制活動(dòng)最直接和可靠的標(biāo)志,也是HBV感染最為直接的證據(jù)。對(duì)于乙肝血清標(biāo)志物與HBV-DNA的關(guān)系,近年來(lái)國(guó)內(nèi)曾有多篇研究報(bào)道[1-2],表1結(jié)果顯示,第1組和第3組,HBV-DNA檢出率最高(94.9%和94.3%),且拷貝測(cè)定值最高,與國(guó)內(nèi)部分地區(qū)的報(bào)道相似[3-4];第1組和3組都含有HBsAg和HBeAg陽(yáng)性,HBV-DNA陽(yáng)性率顯著高于其他組。HBsAg是HBV感染后第1個(gè)出現(xiàn)的血清學(xué)標(biāo)志物,HBsAg陽(yáng)性表示存在HBV感染。HBeAg是HBV活動(dòng)性復(fù)制的指標(biāo)之一,HBeAg陽(yáng)性表示病毒在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制活躍,傳染性強(qiáng),對(duì)肝細(xì)胞破壞嚴(yán)重。有研究發(fā)現(xiàn),HBV-DNA與HBeAg和HBsAg存在相關(guān)性,但其濃度間并不呈正線性相關(guān)。HBeAg陽(yáng)性的標(biāo)本,HBV-DNA通常有較高的拷貝濃度,從表1中可以看出,HBeAg陽(yáng)性患者的HBV-DNA濃度明顯高于HBeAg陰性患者的 HBV-DNA濃度。抗-HBe出現(xiàn)于HBeAg轉(zhuǎn)陰后,抗-HBe出現(xiàn)表示病變趨向好轉(zhuǎn),病毒復(fù)制水平降低,病變趨于靜止,血中HBV-DNA濃度較低或陰性。從表1的檢測(cè)結(jié)果可以看出有的“小三陽(yáng)”即HBeAg陰性而抗-HBe陽(yáng)性的患者HBV-DNA濃度也較高,那是由于HBV基因組前C區(qū)發(fā)生突變時(shí),使HBeAg無(wú)法檢出,此時(shí)HBV復(fù)制仍活躍,HBV-DNA濃度也較高,病變可持續(xù)進(jìn)展。但在HBeAg陽(yáng)性者中仍有部分HBV-DNA為陰性,這可能與血清HBVDNA復(fù)制水平低或病毒發(fā)生變異有關(guān)[5],但其中有38例HBV-DNA為陰性,而其他文獻(xiàn)[6-7]也顯示大三陽(yáng)中 HBVDNA并非100%,其原因?yàn)闊晒舛烤酆厦告湻磻?yīng)(FQ-PCR)只能檢測(cè)血中游離的HBV-DNA,當(dāng)病毒整合到肝細(xì)胞染色體上,隨同肝細(xì)胞一起復(fù)制、表達(dá),ELISA可出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng),但血清中卻并不存在乙肝病毒顆粒,而導(dǎo)致FQ-PCR結(jié)果為陰性;另外當(dāng)感染的HBV-DNA發(fā)生突變時(shí),不能與熒光探針結(jié)合,F(xiàn)Q-PCR結(jié)果亦為陰性,而ELISA可為陽(yáng)性。因此對(duì)于ELISA結(jié)果為大三陽(yáng)而HBV-DNA為陰性者,應(yīng)做具體分析,確定是什么原因所致。

    一直認(rèn)為,HBeAg陰性提示血清 HBV-DNA復(fù)制水平低,傳染性或病情趨向穩(wěn)定或恢復(fù)。但在本研究中發(fā)現(xiàn)第2組、4組、5組、7組 HBeAg陰性,336例標(biāo)本中出現(xiàn)138例HBV-DNA陽(yáng)性,表明即使體內(nèi)有多種抗體產(chǎn)生,部分患者仍具有病毒的復(fù)制與傳染性,這可能與HBV發(fā)生前C區(qū)基因突變、機(jī)體發(fā)生特異性的免疫耐受有關(guān)。如果僅以HBeAg的檢測(cè)結(jié)果作為判斷HBV感染、傳染性以及HBV是否在體內(nèi)復(fù)制有一定的局限性,因此,應(yīng)選擇檢測(cè)HBV-DNA作為體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制的標(biāo)準(zhǔn)。

    研究發(fā)現(xiàn),第5組 HBsAg陰性(抗-HBe、抗-HBc均陽(yáng)性),仍發(fā)現(xiàn)有14.3%的 HBV-DNA陽(yáng)性,且拷貝數(shù)在104copy/mL左右。其原因可能由于:①HBV發(fā)生變異,其前S區(qū)變異率比S區(qū)高2倍;前C/C區(qū)變異研究較多。②HBsAg的表達(dá)可能較低或其抗原性改變較大,用現(xiàn)有的試劑檢測(cè)不出。③形成免疫復(fù)合物,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)血中免疫復(fù)合物的存在可能影響 HBsAg的檢出[8]。第2,4,6組,雖然 HBV-DNA陽(yáng)性率低于1組和3組,但陽(yáng)性率仍然較高,說(shuō)明雖然HBeAg陰性,但病毒并沒(méi)有停止復(fù)制,只是復(fù)制減緩或部分患者出現(xiàn)病毒基因變異。這樣的感染更易對(duì)患者造成傷害,嚴(yán)重者可發(fā)展為肝硬化或肝癌[9]。第7組僅HBsAg陽(yáng)性的72例感染者中有30例HBV-DNA陽(yáng)性,檢出率為41.7%,這可能是HBV活躍的早期,血清中其他標(biāo)志物還沒(méi)有出現(xiàn),因此這種病例亦可能具有較高的傳染性。有文獻(xiàn)報(bào)道[10],乙肝病毒血清標(biāo)志物各種表現(xiàn)形式均可能存在不同程度的HBV復(fù)制,只是因時(shí)間短,有些表現(xiàn)形式可能由于檢測(cè)數(shù)量、檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑差異等原因?qū)е履承┍憩F(xiàn)模式檢出率低。

    因此,采用FQ-PCR檢測(cè)乙肝病毒感染者 HBV-DNA含量,同時(shí)采用ELISA測(cè)定乙肝病毒標(biāo)志物,有助于了解患者病毒復(fù)制水平,對(duì)乙肝的臨床診斷,特別是為抗病毒治療方案的選擇提供科學(xué)依據(jù)[11]。同時(shí),在抗病毒治療后HBV-DNA轉(zhuǎn)陰的患者,檢測(cè)HBeAg/抗-HBe動(dòng)態(tài)消長(zhǎng)過(guò)程,觀察 HBsAg的變化,有助于判斷治療終點(diǎn)和調(diào)整治療方案[12]。

    由此可見(jiàn),僅依靠乙肝病毒血清標(biāo)志物檢測(cè)診斷HBV感染是不夠的,它只能較好地反映機(jī)體對(duì)HBV感染的免疫應(yīng)答狀況,而FQ-PCR可以定量檢測(cè) HBV-DNA濃度,且靈敏度高、特異性強(qiáng),更能清楚地反映乙肝患者的病毒活動(dòng)程度,真實(shí)地反映HBV的感染和復(fù)制情況。只有將兩種檢測(cè)方相結(jié)合對(duì)乙肝患者進(jìn)行綜合分析,才能對(duì)臨床診斷、治療方案設(shè)計(jì)及藥物療效觀察提供可靠的依據(jù)。

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