阿托伐他汀對(duì)oxLDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞Lkn-1表達(dá)的影響

巨名飛 崔春燕 李金萍 張愛文 侯瑞田

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)伴隨其發(fā)展始終［1］。炎性因子和炎性細(xì)胞間相互作用是AS發(fā)病機(jī)制的核心。抗炎治療作為一種有效的治療手段，越來越受到人們的重視。白細(xì)胞誘素-1(Lkn-1)是新發(fā)現(xiàn)的炎性因子，具有強(qiáng)烈趨化白細(xì)胞向炎癥損傷部位快速聚集，促使前炎性介質(zhì)釋放和血栓形成的作用。國外有報(bào)道Lkn-1與AS的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系［2］。阿托伐他汀為，除具有調(diào)酯作用外，還具有抗炎、改善血管內(nèi)皮功能、抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等作用，近年他汀抗炎作用越來越受心血管領(lǐng)域重視，在降低心血管事件發(fā)生率上起著重要作用［3，4］。本實(shí)驗(yàn)以ox-LDL誘導(dǎo)的U937細(xì)胞形成的泡沫細(xì)胞為AS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察阿托伐他汀對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)U937細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞過程中炎性因子Lkn-1表達(dá)的影響，進(jìn)而研究其動(dòng)脈粥樣硬化過程中的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 阿托伐他汀提取物輝瑞公司饋贈(zèng)。佛波酯購自Sigma公司。鼠抗人Lkn-1抗體購自R＆D公司。RPMI-1640培養(yǎng)基和Trizol購自Gibco公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、10 mmol/L dNTP、Oligo(dT)購自 Promega公司。引物由上海生工合成。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 氧化型低密度脂蛋白制備 低密度脂蛋白(LDL)的純化、氧化修飾及鑒定采集健康成人空腹12 h后新鮮混合靜脈血，加入100 mmol/L EDTA抗凝。采用超速離心法分離離心速度42 000 r/min獲得LDL提取液，經(jīng)瓊脂糖電泳顯示為單一蛋白帶。將LDL置于含10μmol/L CuSO4的PBS溶液(pH值7.4)中，37℃溫育24 h。氧化后的LDL置含200μmol EDTA的PBS中透析24 h，PBS再透析24 h，過濾除菌后4℃保存。LDL中的脂過氧化物在氧化過程中增加，顏色也由逐漸變淺。瓊脂糖電泳顯示，OxLDL的電泳遷移速率快于未氧化的LDL。

1.3 U937細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 人U937單核細(xì)胞株由吉林大學(xué)基礎(chǔ)免疫教研室饋贈(zèng)。細(xì)胞懸浮樣生長(zhǎng)于含10%高溫滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3天換液1次。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 每次實(shí)驗(yàn)前用100 nmol/L佛波酯孵育U937單核細(xì)胞72 h，使其誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，換無血清24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h后加處理因素。將細(xì)胞隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組(對(duì)照組):U937巨噬細(xì)胞置于無血清24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)中。模型組(ox-LDL組):在U937巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入ox-LDL 100 mg/L，阿托伐他汀低濃度組(AV1組):在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入阿托伐他汀(0.1μmol/L)，然后加入ox-LDL 100 mg/L。阿托伐他汀中濃度組(AV2組):在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入阿托伐他汀的濃度為1μmol/L。阿托伐他汀高濃度組(AV3):在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入阿托伐他汀10μmol/L。各組設(shè)3復(fù)孔，于5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)Lkn-1蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞上清液，包被:于96孔酶標(biāo)板每孔中加各組上清100μl及0.01%碳酸鹽buffer(PH9.6)100μl，4℃過夜。棄上清，PBST緩沖液洗3次，5 min/次。加入封閉液(0.1%BSAPBS)100μl/孔，37℃ 30 min。棄上清，PBST緩沖液洗3次，5 min/次。加入一抗鼠抗人Lkn-1工作液(由鼠抗人Lkn-1貯存液按1∶100稀釋而成)100μl/孔，37℃ 2 h。棄上清，PBST緩沖液洗3次，5 min/次。加入抗兔的 HRP標(biāo)記的二抗，100μl/孔，37℃ 2 h。棄上清，PBST緩沖液洗3次，5 min/次。顯色:加入顯色劑100μl/孔，37℃ 30 min;產(chǎn)物顏色逐漸由無色轉(zhuǎn)為橙黃色。加終止液50μl/孔，用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。測(cè)量:酶標(biāo)儀測(cè)定OD 490 nm值，記錄結(jié)果。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)Lkn-1 mRNA的表達(dá) 收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，溶于無Rnase水中，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280的比值在1.8～2.0。分別取1μg RNA在20μl反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;取5μl cDNA于50μl反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增Lkn-1引物，上游:5’-ATCCTACACCCCACGAAGCAT-3 ’，下游:5’-AATTCTTCCTGGTCTTGATCCG-3’(169bp)。內(nèi)參GAPDH引物，上游:5’-ACCACAGGCCATGCCATCAC-3’，下游:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(450bp)。PCR產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠(含0.5μg/ml溴化乙錠)3 V/cm電泳分離，對(duì)電泳條帶進(jìn)行掃描定量分析并攝像，應(yīng)用作為GAPDH內(nèi)參照。Lkn-1 mRNA表達(dá)分析:采用Image Master VDS進(jìn)行光密度掃描(IOD)，以各組Lkn-1條帶和相應(yīng)GAPDH的條帶的IOD比值表示Lkn-1表達(dá)的強(qiáng)弱。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 U937單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變光學(xué)顯微鏡下U937細(xì)胞呈圓形、懸浮狀態(tài)，經(jīng)100 nmol/L PMA誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮?、橢圓形或不規(guī)則形，由懸浮變?yōu)橘N壁狀態(tài)，且伸展偽足，細(xì)胞體積增大，表明已經(jīng)分化為巨噬細(xì)胞。再與100 mg/L ox-LDL孵育后油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)含許多紅色脂類顆粒物質(zhì)，提示AS泡沫細(xì)胞模型制備成功。

2.2 ELISA方法檢測(cè)Lkn-1蛋白的表達(dá)結(jié)果表明 正常狀態(tài)下，U937巨噬細(xì)胞可以表達(dá)少量的Lkn-1。ox-LDL組與C組比較Lkn-1表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，應(yīng)用不同濃度的阿托伐他汀干預(yù)后，與ox-LDL組相比較，Lkn-1的表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)。且隨阿托伐他汀濃度的增加，Lkn-1的表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì)。見表1。

表1 不同濃度的阿托伐他汀對(duì)Lkn-1蛋白表達(dá)的影響

2.3 RT-PCT檢測(cè)Lkn-1基因的結(jié)果 C組中Lkn-1條帶顏色較淺，ox-LDL作用U937MΦ24 h后條帶顏色明顯加深;加用不同濃度的阿托伐他汀后，Lkn-1條帶顏色比ox-LDL組變淺。ox-LDL組與C組比較Lkn-1表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，這與ELISA結(jié)果基本一致。見表2。

表2 5組細(xì)胞上清液中Lkn-1與內(nèi)參積分光密度比值

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種損傷性炎性反應(yīng)疾病，在其形成與發(fā)展過程中有大量炎性因子的參與［5］。炎性因子在AS中的作用已受到廣大學(xué)者的重視。Lkn-1是新發(fā)現(xiàn)的由巨噬細(xì)胞分泌的CC趨化因子，受體為CCR1或CCR3［6］。功能與MCP-1功能相近，對(duì)人外周血中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞具有強(qiáng)大的化學(xué)趨化性，參與炎癥免疫反應(yīng)。此外，還可誘導(dǎo)其它炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)血栓形成等作用。國外有報(bào)道Lkn-1和與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系密切。它可以強(qiáng)烈趨化血液循環(huán)中的白細(xì)胞向炎癥部位聚集。而白細(xì)胞、單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮下遷移是AS早期最重要的始動(dòng)環(huán)節(jié)。研究表明，在AS的早期病灶中已有Lkn-1的表達(dá)，而且這種表達(dá)受病理生理狀態(tài)、代謝產(chǎn)物、氧化應(yīng)激等多因素的影響。

Ox-LDL是致AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，它可通過多重途徑參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程，ox-LDL引起內(nèi)皮功能障礙，啟動(dòng)AS始動(dòng)環(huán)節(jié)［6］;趨化單核細(xì)胞并誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成;誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡;促進(jìn)粥樣斑塊的破裂和血栓形成;誘導(dǎo)自身抗體與其形成循環(huán)免疫復(fù)合物。不僅如此，它還可作為炎癥反應(yīng)過程中潛在的誘導(dǎo)劑，正向調(diào)節(jié)AS中主要細(xì)胞表達(dá)一些炎性因子，如 C-反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等［7］。由于生物連鎖反應(yīng)，這些因子又可刺激炎細(xì)胞分泌更多炎癥因子，形成正反饋級(jí)聯(lián)放大炎癥反應(yīng)，加速AS的發(fā)展，導(dǎo)致心血管不良事件的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中用濃度為100 mg/L的ox-LDL作用于培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)ox-LDL組較對(duì)照組Lkn-1的表達(dá)明顯增加。進(jìn)一步證明ox-LDL可發(fā)揮類似于前炎癥介質(zhì)的作用，刺激炎性因子的表達(dá)。這是其致AS形成的重要機(jī)制之一。

Lkn-1是新發(fā)現(xiàn)的炎性細(xì)胞因子，在炎性反應(yīng)中起著重要作用［8］，表現(xiàn)為趨化單核細(xì)胞遷移至內(nèi)皮下，誘導(dǎo)其他炎性因子表達(dá)和分泌，加速血栓的形成。有研究表現(xiàn):Lkn-1具有誘導(dǎo)炎細(xì)胞表達(dá)和分泌炎性因子的作用。Lee等［9］應(yīng)用Lkn-1處理人單核細(xì)胞白血病(THP-1)細(xì)胞株15 min，即可上調(diào)與AS斑塊形成有關(guān)的炎癥因子IL-8、MCP-1和TNF-αmRNA的表達(dá)。這些細(xì)胞因子在AS的多個(gè)環(huán)節(jié)中分別發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)一步激活炎細(xì)胞。這樣炎性介質(zhì)與炎細(xì)胞之間形成一正反饋通路，級(jí)聯(lián)放大炎性反應(yīng)，推進(jìn)AS的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)證明在泡沫細(xì)胞中有大量炎性因子Lkn-1表達(dá)，說明Lkn-1參與動(dòng)脈粥樣硬化過程。

他汀類藥物可有效降低低密度脂蛋白水平，對(duì)炎性反應(yīng)具有抑制作用，可減少巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞因子表達(dá)。本研究用ox-LDL誘導(dǎo)U937細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，不同濃度阿托伐他汀干預(yù)后，與正常對(duì)照組相比，Lkn-1表達(dá)減少，且與阿托伐他汀的劑量有濃度依賴關(guān)系。阿托伐他汀可通過抑制ox-LDL誘導(dǎo)U937細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞過程中Lkn-1的表達(dá)，發(fā)揮穩(wěn)定粥樣斑塊和抗炎作用，其抗AS作用可能是通過抑制炎性因子的釋放，減輕炎性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，但其通過何種信號(hào)通路減少炎性因子的釋放還有待進(jìn)一步研究。

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