大豆分離蛋白與甜菜果膠靜電復(fù)合過程的研究

謝晶晶，章軼鋒，李玉輝，孔慧玲，方亞鵬

(湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部食品與制藥工程學(xué)院，菲利普斯親水膠體研究中心，湖北武漢430068)

蛋白質(zhì)和多糖是兩類重要的天然高分子，單獨(dú)使用時(shí)其性能無法滿足實(shí)際需要，而蛋白質(zhì)與多糖的復(fù)合物顯示出更為優(yōu)越的性能［1］。研究者利用蛋白質(zhì)與多糖的相互作用設(shè)計(jì)和制作出新穎且具有更多功能(比如組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)地、形態(tài)、氣味等)的食品［2-3］。蛋白質(zhì)與多糖的相互作用特別是靜電復(fù)合被證實(shí)受一系列因素的影響，包括pH、離子強(qiáng)度、離子類型、蛋白質(zhì)與多糖比例、電荷密度、高分子的形狀和尺寸等。在諸多因素中，蛋白質(zhì)與多糖比例、pH和離子強(qiáng)度是關(guān)鍵因素，因?yàn)樗鼈儧Q定了蛋白質(zhì)與多糖攜帶的電荷數(shù)量［4-6］。在一定的pH下，作為電解質(zhì)的蛋白質(zhì)與多糖可能發(fā)生靜電相互作用，且隨著蛋白質(zhì)與多糖比例的不同，形成不同的復(fù)合物:包括可溶復(fù)合物，液態(tài)凝聚物或固體沉淀［7-8］。在國(guó)內(nèi)，利用蛋白質(zhì)與多糖的相互作用研究復(fù)合物的凝膠質(zhì)構(gòu)特性、起泡性、乳化穩(wěn)定性等已有一些報(bào)道［9-11］，但有關(guān)蛋白質(zhì)和多糖的相互作用機(jī)理及具體結(jié)構(gòu)演變的實(shí)驗(yàn)鮮有報(bào)道。本文研究了GDL在線酸化誘導(dǎo)SPI與SBP之間的靜電復(fù)合，探討復(fù)合物的形成機(jī)理及結(jié)構(gòu)演變過程，建立靜電復(fù)合物在pH-混合比率坐標(biāo)下的詳細(xì)相圖。該研究為蛋白質(zhì)與多糖混合體系的復(fù)合凝聚提供了進(jìn)一步的理論補(bǔ)充，為提高和擴(kuò)展蛋白質(zhì)-多糖體系的功能性提供了依據(jù)。在低pH時(shí)，SPI接近等電點(diǎn)而發(fā)生溶解性不好的現(xiàn)象，限制了SPI在食品中的應(yīng)用，擬通過向SPI中添加一定量的SBP提高SPI在低pH情況下的可溶性［12］。SBP含有一定量的蛋白質(zhì)，具有很好的乳化活性，但缺乏良好的乳化穩(wěn)定性，擬通過向SBP中添加大豆分離蛋白提高SBP的乳化穩(wěn)定性［13］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPI 安陽漫天雪食品制造有限公司，MW=5.216×104u，90%蛋白質(zhì)，9%水分，1%灰分;SBP 日本三榮源有限公司，MW=2.263×106u;GDL 美國(guó)Sigma公司;微孔濾膜 上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠;疊氮化鈉、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SRT202滾軸式混合器 廈門市其林貝爾儀器制造有限公司;GL21M智能高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司;EL204分析天平、ORION 4 STAR pH酸度計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Zetasizer Nano-ZS激光粒度及電位滴定分析儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司;TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SPI和SBP溶液制備 分別取1g粉末溶于100g去離子水(加入0.005wt%疊氮化鈉防止微生物生長(zhǎng))，置于滾軸式混合器上搖勻過夜，待溶解充分后，在10000r/min下冷凍離心50min后取上清液，SPI上清液用0.22μm過濾膜(混合纖維素酯膜)過濾，SBP上清液用0.45μm過濾膜(混合纖維素酯膜)過濾。取5～6g過濾后樣品稱得質(zhì)量為W1，通過烘干干重法烘干后稱得質(zhì)量為W2，測(cè)定其樣品濃度，濃度(%)=(W2/W1)×100。

1.2.2 SPI/SBP混合物制備 根據(jù)所需不同混合比例，配制 SPI與 SBP混合液共 40g(總濃度為0.1wt%)，從混合液中稱取3份，每份10g，用0.1mol/L NaOH和0.1mol/L HCl將混合液pH調(diào)為8.0，待用。1.2.3 ξ-電位測(cè)定 分別稱取0.1wt%SPI、0.1wt%SBP及不同混合比例的SPI/SBP溶液(總濃度為0.1wt%)12g左右，使用Zetasizer Nano-ZS激光粒度及電位滴定分析儀在溫度為25℃時(shí)測(cè)定不同pH下的ξ-電位(光散射檢測(cè)角度為 17°，激光器波長(zhǎng)633nm，He/Ne氣體激光器功率4mW)。設(shè)置pH從10.0降至2.0，pH每變化0.5時(shí)記錄ξ-電位。

ξ-電位可以用來表征體系的帶電情況，在施加電場(chǎng)下，帶電粒子會(huì)發(fā)生電泳遷移，Henry方程描述了ξ-電位和電泳遷移率UE間的關(guān)系:

式中:ξ(mV):體系 ξ-電位，η(Pa ﹒ s):分散體系粘度，ε:分散體系介電常數(shù)，f(ka)為 Henry 函數(shù)［14］。

1.2.4 GDL在線酸化過程 將1.2.2配制好的10g混合物，根據(jù)需要，添加不同質(zhì)量的GDL。GDL在水溶液中水解為葡萄糖酸，形成葡萄糖酸和葡萄糖酸內(nèi)酯的平衡溶液，葡萄糖酸可釋放H+，使得溶液酸化。其水解過程和酸化過程緩慢，可以自動(dòng)監(jiān)測(cè)溶液pH的連續(xù)變化。迅速搖勻后，采用ORION 4 STAR pH酸度計(jì)連續(xù)測(cè)定200min內(nèi)混合物在酸化過程中pH隨時(shí)間的變化，測(cè)定溫度為25℃。

1.2.5 在線酸化過程中散射光強(qiáng)和流體力學(xué)半徑的測(cè)定 將1.2.2配制好的10g混合物，添加GDL迅速搖勻后，取1mL樣品置于樣品池中，用Zetasizer Nano-ZS激光粒度儀(光散射檢測(cè)角度為173°，激光器波長(zhǎng)633nm，He/Ne氣體激光器功率4mW)連續(xù)測(cè)定200min內(nèi)混合物在酸化過程中散射光強(qiáng)(I173)和流體力學(xué)半徑(Rh)隨時(shí)間的變化，每分鐘讀取數(shù)值一次，測(cè)定溫度為25℃。

1.2.6 在線酸化過程中濁度的測(cè)定 將1.2.2配制好的10g混合物，添加GDL迅速搖勻后，取3mL樣品置于樣品池中，用去離子水做空白對(duì)照，用紫外可見分光光度計(jì)在500nm波長(zhǎng)下連續(xù)測(cè)定200min內(nèi)混合物在酸化過程中濁度(τ)隨時(shí)間的變化，每分鐘讀取數(shù)值一次，測(cè)定溫度為25℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPI/SBP體系的ξ－電位

pH滴定過程中ξ-電位的變化可以反映整個(gè)體系在不同pH下的帶電情況。ξ-電位是粒子間靜電相互作用的標(biāo)尺，可以用來預(yù)測(cè)分散體系的穩(wěn)定性。體系穩(wěn)定與否通常以ξ-電位的絕對(duì)值是否大于30mV為標(biāo)準(zhǔn)。圖1反映了SPI、SBP和SPI/SBP混合體系(SPI/SBP=2/1)pH滴定過程中ξ-電位的變化。當(dāng)pH降至6.0時(shí)，SPI體系ξ-電位急劇增加，至pH3.0時(shí)趨于平緩。由圖可知，純SPI的等電點(diǎn)為4.4。蛋白質(zhì)分子同時(shí)含有羧基和氨基，在pH高于等電點(diǎn)一側(cè)時(shí)，蛋白質(zhì)帶有凈負(fù)電荷，在低于等電點(diǎn)一側(cè)時(shí)，蛋白質(zhì)帶有凈正電荷。當(dāng)pH降至5.0時(shí)，SBP的ξ-電位急劇增加。純SBP溶液在pH＞5.0時(shí)，ξ-電位值大約為-40mV，當(dāng)pH降至2.0時(shí)，體系的ξ-電位值接近0，這是由SBP所帶羧基基團(tuán)在酸化過程中發(fā)生質(zhì)子化所致［4］。對(duì)于 SPI/SBP=2/1，其等電點(diǎn)約為2.9，介于SPI和SBP的等電點(diǎn)之間。

圖1 ξ-電位隨pH的變化Fig.1 ξ-potential as a function of pH

表1給出了不同混合比例下SPI/SBP的等電點(diǎn)。由表可知，隨著混合體系中SBP含量的增加，等電點(diǎn)逐漸降低。這是因?yàn)檩^多SBP存在時(shí)，SPI需要在更加酸性的條件下，增加自身所帶正電荷，才能中和SBP。當(dāng)pH高于混合體系的等電點(diǎn)時(shí)，整個(gè)體系呈負(fù)電狀態(tài)，說明體系中SPI所帶的正電荷還不足以完全中和SBP所帶的負(fù)電荷，當(dāng)pH低于混合體系的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)所帶正電荷多于SBP所帶的負(fù)電荷，整個(gè)體系呈正電性。

表1 不同混合比例下SPI/SBP體系的等電點(diǎn)Table 1 Isoelectric point of SPI/SBP mixtures as a function of mixing ratio

很多報(bào)道證實(shí)當(dāng)體系中蛋白質(zhì)與多糖帶相反電荷時(shí)，會(huì)發(fā)生靜電吸引，生成復(fù)合物［7，15］。所以對(duì)于SPI/SBP混合物，復(fù)合物的形成應(yīng)該發(fā)生在pH＜4.4，即低于SPI的等電點(diǎn)。

2.2 SPI/SBP靜電復(fù)合過程中散射光強(qiáng)與濁度的變化

散射光強(qiáng)可反映膠體粒子的大小，濁度則是因樣品的吸收或顆粒的散射而造成透射光的衰減，同樣可以反映粒子的大小。散射光強(qiáng)對(duì)分子水平上的結(jié)構(gòu)變化比較敏感，而濁度則相對(duì)于大顆粒(如微米級(jí)別)比較敏感。因此，綜合散射光強(qiáng)和濁度的變化趨勢(shì)可以用來反映不同尺寸、不同結(jié)構(gòu)以及不同穩(wěn)定性的復(fù)合物的形成過程。酸化過程中SPI/SBP混合體系的散射光強(qiáng)和濁度變化如圖2和圖3所示。在不同混合比例下，散射光強(qiáng)和濁度隨pH的降低都出現(xiàn)先緩慢增加后急劇上升再迅速下降的過程。隨著SBP含量的增加，即SPI/SBP的降低，達(dá)到最大散射光強(qiáng)和濁度所對(duì)應(yīng)的pH逐漸下降，這與不同比例混合體系等電點(diǎn)的變化趨勢(shì)是相似的。

圖2 GDL酸化過程中不同混合比例的SPI/SBP散射光強(qiáng)(173°，I173)隨pH的變化Fig.2 Scattered light intensity at 173°(I173)as a function of pH during GDL-induced acidification for SPI/SBP mixtures with different mixing ratios

在連續(xù)測(cè)試過程中，散射光強(qiáng)先增加意味著溶液中可溶粒子發(fā)生了復(fù)合，隨后散射光強(qiáng)的減弱可能是粒子顆粒尺寸增大、顆粒數(shù)量減少所致［16］。濁度的增加意味著顆粒的尺寸已增大至可見光波長(zhǎng)范圍，比如500nm，隨著顆粒尺寸的進(jìn)一步增大，濁度急劇上升至最大，之后由于重力影響，顆粒沉降，濁度減小。

2.3 SPI/SBP靜電復(fù)合過程中特征結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變點(diǎn)的確立

圖3 GDL酸化過程中不同混合比例的SPI/SBP濁度(500nm，τ)隨pH的變化Fig.3 Turbidity at 500nm as a function of pH during GDL-induced acidification for SPI/SBP mixtures with different mixing ratios

比較SPI/SBP=2/1體系的散射光強(qiáng)、濁度和流體力學(xué)半徑隨pH的演變，如圖4所示。pH5.5～4.3這個(gè)區(qū)間，散射光強(qiáng)和濁度值都很低，并基本保持不變。當(dāng)pH＜4.3時(shí)，散射光強(qiáng)開始出現(xiàn)增加，該初始點(diǎn)定義為pHc。當(dāng)4.3＜pH＜3.6時(shí)，散射光強(qiáng)顯著增加并迅速到達(dá)最大值，說明多糖和蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著的復(fù)合，散射光強(qiáng)達(dá)到最大值時(shí)的pH定義為pHφ。同時(shí)在該pH區(qū)間內(nèi)，濁度無顯著變化，說明形成的復(fù)合尺寸仍然小于可見光的波長(zhǎng)，為納米級(jí)別的可溶復(fù)合物。當(dāng)pH＜3.6時(shí)，濁度急劇增加并隨后降低，說明體系開始形成尺寸較大的復(fù)合物，并發(fā)生了沉降。當(dāng)pH＜3.3時(shí)，濁度達(dá)到最大的同時(shí)流體力學(xué)半徑迅速增大，并保持增長(zhǎng)趨勢(shì)，形成了肉眼明顯可見的沉淀，說明體系形成了微米級(jí)別的不可溶復(fù)合物。

圖4 GDL酸化過程中SPI/SBP=2/1混合體系散射光強(qiáng)，濁度以及流體力學(xué)半徑的演變比較Fig.4 Comparison of the evolutions of scattered light intensity，turbidity and hydrodynamic radius during GDL-induced acidification for SPI/SBP=2/1

2.4 SPI/SBP靜電復(fù)合物的相圖

特征pH，如上述定義的pHc和pHφ對(duì)確定分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)至關(guān)重要。傳統(tǒng)意義上，pHc表示散射光強(qiáng)開始緩慢增加，相互作用變得明顯，形成了可溶分子復(fù)合物。pHφ表示散射光強(qiáng)達(dá)到最大，不可溶分子復(fù)合物開始形成。結(jié)合不同比例下SPI/SBP混合體系的pHc，pHφ以及SPI的等電點(diǎn)，繪制了SPI/SBP靜電復(fù)合物在pH-混合比率坐標(biāo)下的相圖，如圖5所示。

該相圖分為四個(gè)區(qū)域:

(I):共溶高分子穩(wěn)定區(qū)，該區(qū)域位于SPI等電點(diǎn)及pHc之上，SPI與SBP都帶有較多的負(fù)電荷，兩者之間的相互作用力以靜電排斥為主，因此它們不能形成靜電復(fù)合物。SPI和SBP以共溶的單個(gè)分子存在。

(Ⅱ):分子內(nèi)可溶復(fù)合物穩(wěn)定區(qū)，該區(qū)域處于SPI的等電點(diǎn)以下及pHc之上。由于pH在SPI等電點(diǎn)以下，SPI帶有凈的正電荷，因此SPI與SBP可通過靜電吸引力形成復(fù)合物。在該區(qū)域內(nèi)，SBP相對(duì)于SPI過量，因此形成的復(fù)合物以SBP分子內(nèi)復(fù)合物占主導(dǎo)［17］。此時(shí)，混合體系的ξ-電位小于-30mV(如圖1)，分子內(nèi)復(fù)合物之間靜電排斥力仍然較強(qiáng)，使它們彼此分開而不至于形成分子間復(fù)合物。

(Ⅲ):分子間可溶復(fù)合物亞穩(wěn)態(tài)區(qū)，該區(qū)域處于pHc和pHφ之間。隨著pH的降低，SPI所帶正電荷增加，超出了SBP提供的復(fù)合位點(diǎn)，此時(shí)過量的SPI可作為橋連點(diǎn)，連接不同的SBP分子進(jìn)而形成SBP分子間復(fù)合物。在該區(qū)域內(nèi)，混合體系的ξ-電位處于-30～-15mV之間，復(fù)合物之間的靜電排斥力變?nèi)?，SPI與SBP間的短程靜電吸引力可克服SBP分子內(nèi)復(fù)合物之間的遠(yuǎn)程靜電排斥力，通過SPI的橋連作用，SBP分子內(nèi)復(fù)合物轉(zhuǎn)化為SBP分子間復(fù)合物。在該區(qū)域內(nèi)分子間復(fù)合物的尺寸增長(zhǎng)仍然受靜電排斥力的限制，復(fù)合物保持可溶性，但是已經(jīng)出現(xiàn)不穩(wěn)定性，為亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)。

(IV)分子間不可溶復(fù)合物，該區(qū)域的pH處于pHφ以下。隨著pH的進(jìn)一步降低，SPI攜帶更多的正電荷，混合體系的ξ-電位＞-15mV，分子復(fù)合物間的靜電排斥力進(jìn)一步減弱，體系穩(wěn)定性顯著變?nèi)?，在SPI橋連的作用下，SBP分子間復(fù)合物進(jìn)一步發(fā)生交聯(lián)、聚集，形成尺寸更大的復(fù)合物，并最終出現(xiàn)相分離或絮狀沉淀。通過光學(xué)顯微鏡可觀察到SPI/SBP體系形成了絮狀沉淀。

圖5 SPI/SBP靜電復(fù)合物的相圖Fig.5 Phase diagram for the electrostatic complex of SPI/SBP

3 結(jié)論

本文利用動(dòng)態(tài)光散射、濁度法以及電位滴定等多種互補(bǔ)手段，系統(tǒng)研究了GDL在線酸化誘導(dǎo)的SPI與SBP之間的靜電復(fù)合。通過散射光強(qiáng)和濁度變化過程中的特征pH，并結(jié)合ξ-電位，建立了SPI/SBP靜電復(fù)合物的詳細(xì)相圖，討論了不同相區(qū)中復(fù)合物的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性。該研究為蛋白質(zhì)與多糖混合體系的復(fù)合凝聚提供了進(jìn)一步的理論補(bǔ)充，為提高和擴(kuò)展蛋白質(zhì)-多糖體系的功能性提供了依據(jù)，比如可用來指導(dǎo)蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物作為新型食品乳化劑的應(yīng)用［17］。

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