杜仲籽油混合脂肪酸制備工藝優(yōu)化及脂肪酸組成分析

吳麗雅，黃 群，余 佶，楊萬根，陳功錫，麻成金，*

（1.吉首大學植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南吉首416000；2.吉首大學食品科學研究所，湖南吉首416000）

α-亞麻酸（α-Linolenic acid，ALA）屬于n-3不飽和脂肪酸，它是人體不能產(chǎn)生，只能從體外獲得的必需的不飽和脂肪酸之一，α-亞麻酸在“必需脂肪酸與人類營養(yǎng)健康國際研討會”上被定為“21世紀綠色營養(yǎng)保健食品”，α-亞麻酸的功效引起了國內(nèi)外專家學者的廣泛興趣。杜仲翅果出籽率為28%，翅果的含油量為30%左右，杜仲籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸，其中α-亞麻酸的含量高達60%，因此杜仲籽油是一種擁有高附加值的功能性油脂[1-3]。本實驗以杜仲籽油為原料，在常壓下，皂化水解制備杜仲籽油混合脂肪酸，并通過響應面法優(yōu)化實驗，得到了制備杜仲籽混合油脂肪酸的優(yōu)化工藝條件，并對脂肪酸的種類和含量進行分析，為進一步分離提取和純化杜仲籽油α-亞麻酸提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲籽油 于2011年采用超臨界CO2萃取而得，并且避光儲存，檢測其皂化值為180mg KOH/g；氫氧化鉀、95%乙醇、鹽酸、無水硫酸鈉、正己烷、濃硫酸等 均為國產(chǎn)分析純；甲醇、正己烷 為色譜純。

HH-S2型恒溫水浴鍋 金壇市成輝儀器廠；PHSJ4A型實驗室pH計 上海精密科學儀器有限公司；101-2AB型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器；FA2004型電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 金壇市成輝儀器廠；TG165型臺式高速離心機 長沙平凡儀器表有限公司；7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Aglient公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 常壓皂化水解制備杜仲籽油脂肪酸的工藝流程 10g杜仲籽油→KOH-乙醇溶液皂化回流→室溫冷卻→正己烷萃取→10%鹽酸酸化皂化物→靜置分層→有機相水洗至中性→脫水、回收正己烷→杜仲籽油混合脂肪酸。

1.2.2 杜仲籽油脂肪酸酸值測定 杜仲籽油脂肪酸酸值的測定參考GB/T 5530-2005/ISO 660：1996方法。

1.2.3 杜仲籽油脂肪酸組成分析 稱量皂化水解后的杜仲籽油脂肪酸1g置于圓底燒瓶中，加入10mL（1∶10，V/V）溶液，放入恒溫水浴鍋中，75℃回流1h，室溫冷卻，用正己烷萃取2次，合并兩次萃取液，蒸餾水洗滌多次，無水硫酸鈉干燥，5000r/min離心10min，取上清液備用[4-5]。

色譜條件：Agilent 190191S-433型石英毛細管柱（325℃，30min×250min×0.25μm），載氣為高純度的氦氣（99.999%），柱前壓69.8kPa，柱內(nèi)載氣流速2mL/min；升溫程序：80℃保持2min，以10℃/min升溫到160℃，保持2min，再以5℃/min升溫到250℃，保持5min，載氣流速1mL/min，分流比80∶1，進樣量1μL。質(zhì)譜條件：EI離子源230℃，溶劑延遲4min，電子能量70eV，分辨率1000。

1.3 單因素實驗設計

每次實驗稱取杜仲籽油10g，分別對超量堿（占理論堿量）（25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%），KOH-乙醇溶液/油的比例（mL∶g）（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7：1），皂化溫度（60、65、70、75、80、85、90℃），皂化時間（40、50、60、70、80、90、100min），酸化pH（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5）進行單因素實驗，考察各個因素對杜仲籽油混合脂肪酸酸值的影響。

1.4 響應面優(yōu)化實驗設計

響應面法是通過回歸方程擬合單因素實驗得到的數(shù)據(jù)，評價指標和因素間的非線性關系，得到了最優(yōu)的工藝參數(shù)[11-13]。應用SAS 9.1數(shù)據(jù)分析軟件，根據(jù)Box-Behnken實驗設計原理，綜合單因素實驗結(jié)果，以杜仲籽油脂肪酸酸值為響應值，選取超量堿、皂化溫度、皂化時間和酸化pH為考察因素，優(yōu)化制備杜仲籽油混合脂肪酸，實驗因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 超量堿對杜仲籽油脂肪酸酸值的影響 10g杜仲籽油，在恒定KOH理論用量1.8g，皂化溫度75℃，皂化時間80min，酸化pH為2.5條件下，考察不同超量堿對酸值的影響，如圖1所示。

杜仲籽油的皂化值為180mg KOH/g，因此根據(jù)皂化值確定每10g杜仲籽油需要理論堿量為1.8g KOH，但因為KOH是強堿，易吸收空氣中的水分而發(fā)生潮解，而且在皂化反應中不僅是催化劑，并且可以中和反應生成脂肪酸得到脂肪酸鉀鹽使反應向正方向進行，因此，實際操作中需要KOH量要高。由圖1可見，隨著超量堿的增多，皂化逐漸完全，杜仲籽油的酸值逐漸增大[6]。當超量堿為50%時，酸值達到最大。KOH用量過多，后面酸解和水洗會對脂肪酸產(chǎn)生影響，使杜仲籽油脂肪酸酸值減小，因此，選擇KOH用量高于理論用量50%。

2.1.2 KOH乙醇溶液/油的比例對杜仲籽油脂肪酸酸值的影響 10g杜仲籽油，在恒定KOH理論用量1.8g，加入超量堿50%，皂化溫度75℃，皂化時間80min，酸化pH為2.5條件下，考察不同KOH乙醇溶液/油的比例對酸值的影響，如圖2所示。

在皂化反應中，油脂含水量少，KOH不易溶解，而油脂、KOH和水會在乙醇的作用下形成了一個均相體系，為加快反應速度，KOH乙醇溶液/油比例對酸值有不同的影響。由圖2可知，KOH乙醇溶液和油的比例小于4∶1時，皂化反應不完全，生成脂肪酸鉀鹽溶液，而當乙醇溶液過量時，不僅反應速度降低，生成粘性大的中間皂，使酸值減小，而且，增加乙醇用料，提高成本[7]。因此，KOH乙醇溶液/油的適宜比例是4∶1。

2.1.3 皂化溫度對杜仲籽油脂肪酸酸值的影響 10g杜仲籽油，在恒定KOH理論用量1.8g，加入超量堿50%，皂化時間80min，酸化pH2.5條件下，考察不同皂化溫度對酸值的影響如圖3所示。

隨著皂化溫度的升高，反應物的活性增大，利于油和堿的混合，反應速率加快，皂化水解越完全，酸值也逐漸增大[8]。在75℃時，混合脂肪酸的酸值最大，當溫度高于75℃時，部分不飽和脂肪酸穩(wěn)定性會降低，酸值會減小，因此選擇皂化溫度為75℃為宜。

2.1.4 皂化時間對杜仲籽油脂肪酸酸值的影響 10g杜仲籽油，在恒定KOH理論用量1.8g，加入超量堿50%，皂化溫度75℃，酸化pH2.5條件下，考察不同皂化時間對酸值的影響如圖4所示。

隨著皂化時間的增加，混合脂肪酸的酸值在逐漸增大，當皂化時間為80min時，皂化完全，脂肪酸的酸值達到了最大，時間進一步延長，杜仲籽油已皂化完全，對酸值影響不大，但由于時間增加，熱量逐漸增多，溫度升高，所含的不飽和脂肪酸會部分氧化，酸值有所減小，并且造成了不必要的損失[9-10]。因此，皂化時間選擇80min。

2.1.5 酸化pH對杜仲籽油脂肪酸酸值的影響 10g杜仲籽油，在恒定KOH理論用量1.8g，加入超量堿50%，皂化溫度75℃，皂化時間內(nèi)80min條件下，考察酸化時不同pH對酸值的影響如圖5所示。

鹽酸酸解脂肪酸鉀鹽得到脂肪酸，因為脂肪酸鉀鹽中的羧基具有得質(zhì)子能力，而鹽酸具有給予質(zhì)子的能力。pH較小時，體系中H+較多，酸化易進行，而隨著pH逐漸增大，即H+逐漸減少，酸化不易進行，杜仲籽油脂肪酸酸值減小，因此，酸化pH選擇2.5。

2.2 響應面法優(yōu)化實驗結(jié)果與分析

2.2.1 Box-Behnken實驗因素水平和實驗方案 在前期單因素實驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken實驗設計原理，每組稱取10g杜仲籽油，恒定KOH理論用量1.8g，KOH乙醇溶液/油的比例為4∶1，選取超量堿、皂化溫度、皂化時間和酸化pH四個因素，采用四因素三水平實驗設計優(yōu)化實驗，每組酸值測三次，取其平均值，實驗方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken實驗方案設計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

2.2.2 各因素與杜仲籽油脂肪酸酸值模型的建立與檢驗 應用SAS9.1軟件對表2中實驗結(jié)果進行回歸擬合分析，回歸模型方程如下：

Y=157.1333+7.7275X1+7.470833X2+3.865X3+4.893333X4-0.3875X1X2-0.77X1X3+3.475X1X4-0.39X2X3+3.865X2X4+0.384X3X4-14.555X12-13.7825X22-13.39625X32-11.07875X42

通過方差分析及相關系數(shù)檢查該回歸模型的可靠性，結(jié)果見表3。

由表3可知，模型p=0.0001＜0.01，回歸模型極顯著，回歸方程的復相關系數(shù)R2=0.9717，調(diào)整后復相關系數(shù)R2Adj=0.9387，說明該模型擬合度較好，而且失擬項p=0.069＞0.05檢驗不顯著，表明了杜仲籽油脂肪酸實際酸值和預測酸值擬合度較高，因此該模型可以確定制備杜仲籽油混合脂肪酸的最佳工藝條件。一次項X1、X2、X3、X4和二次項X12、X22、X32、X42均達到了極顯著的水平；方差分析表中F值表明各個因素對酸值影響的順序是：超量堿＞皂化溫度＞酸化pH＞皂化時間，而且X1X4和X2X4即超量堿和酸化pH、皂化溫度和酸化pH的交互作用達到了顯著水平，說明了各個因素對杜仲籽油混合脂肪酸的影響是非線性關系[11-14]?；貧w方程簡化為：Y=157.1333+7.7275X1+7.470833X2+3.865X3+4.893333X4+3.475X1X4+3.865X2X4-14.555X12-13.7825X22-13.39625X32-11.07875X42。

表4 杜仲籽油混合脂肪酸組成及相對含量Table 4 Fatty acid and relative contents in Eucommia ulmoids oliv seed oil

2.2.3 響應面分析 響應曲面圖是響應值和對應的個因素所構(gòu)成的三維曲面圖。常壓皂化水解制備杜仲籽油脂肪酸的響應面分析和優(yōu)化模型中交互作用顯著的曲面圖見圖6和圖7。曲面的陡峭可以反映該實驗因素對響應值的影響大小，曲面越陡，影響越大，反之影響小。由圖6可知，超量堿的曲面較陡，而酸化pH的曲面較平緩，說明超量堿對杜仲籽油混合脂肪酸酸值的影響大于pH。由圖7看出。皂化溫度曲面較酸化pH陡，說明了皂化溫度對杜仲籽油混合脂肪酸的影響大于酸化pH的影響[11-14]。

2.2.4 最佳工藝條件確定和驗證實驗 為了確定最佳點，對回歸方程求一階偏導，并令其為0得出了最佳水平值：X1=0.29639，X2=0.31034，X3=0.13587，X4=0.32382，Y=160.49，通過編碼公式Xi=（xi-xo）/△j將編碼值轉(zhuǎn)變成實際參數(shù)：超量堿為51.48195%，皂化溫度76.5517℃，皂化時間81.3587min，酸解pH為2.66191。

考慮到實際操作的方便，按照實際操作值，超量堿為52%，皂化溫度77℃，皂化時間82min，酸化pH為2.7條件下測得實際酸值為159.19mg KOH/g，相對標準偏差為0.81%，表明了與理論預測值相差不大，而且高于優(yōu)化實驗組中的數(shù)據(jù)，說明Box-Behnken優(yōu)化實驗得到的制備杜仲籽油混合脂肪酸的優(yōu)化工藝條件是可靠的。

2.3 杜仲籽油混合脂肪酸GC-MS分析結(jié)果

皂化水解制得的杜仲籽油混合脂肪酸甲酯化后，分析脂肪酸組成，并用GC-MS隨機帶的NIST 08譜庫進行定性分析，匹配度大于99%的脂肪酸見表4，采用峰面積歸一法分析相對含量，杜仲籽油脂肪酸的離子流程圖見圖8。

圖8 杜仲籽油脂肪酸總離子流程圖Fig.8 Total ionization chromatogram of eucommia ulmoids oliv seed oil fatty acid

從表4看出，杜仲籽油混合脂肪酸中含有不飽和脂肪酸為棕櫚油酸、亞油酸、油酸和α-亞麻酸，相對含量高達87.84%，其中α-亞麻酸的相對含量為60.14%，與未皂化水解杜仲籽油的組成和含量相近[15]。

3 結(jié)論

通過單因素實驗和響應面法優(yōu)化實驗，綜合上述分析，建立了回歸方程，確定了杜仲籽油混合脂肪酸制備優(yōu)化工藝條件為：超量堿52%，皂化溫度77℃，皂化時間82min，酸化pH為2.7，在此優(yōu)化條件下測得實際酸值為159.19mg KOH/g，與模型的理論預測值相近，相對標準偏差為0.81%，說明模型具有很好的實用性。

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對杜仲籽油混合脂肪酸進行分析可知，制得杜仲籽油混合脂肪酸中含有肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸、油酸和α-亞麻酸等脂肪酸，不飽和脂肪酸相對含量達87.84%，其中α-亞麻酸的相對含量為60.14%，可以作為下一步分離提取杜仲籽油α-亞麻酸的原料。

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