中藥六味地黃湯抗大鼠卵巢組織衰老的機制

王方娜 李亞麗 楚偉 何金波

衰老是一個復(fù)雜的形態(tài)與功能變化的過程，細胞周期停滯于G1期是細胞衰老的一個關(guān)鍵特征。目前研究較為明確的細胞衰老途徑主要有兩條［1］：p19ARF/p53/p21Cip1和p16INK4a/Rb途徑。這兩條衰老途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子是幾個抑癌基因：p53、p19ARF、Rb和p16INK4a。一旦這些基因發(fā)生突變，細胞將發(fā)生早老或繞過衰老程序繼續(xù)增殖。因此通過抑制衰老途徑中相關(guān)基因表達的治療已成為防治衰老的新策略。近年來大量文獻報道性腺功能衰退與機體衰老密切相關(guān)［1，2］。研究性腺衰老機制及藥物的調(diào)節(jié)作用已成為衰老研究的熱點之一，而且主要集中在雄性性腺衰老的研究［2-4］，但對于雌性性腺衰老的研究報道尚少。本研究應(yīng)用D-半乳糖連續(xù)腹腔注射法制造雌性大鼠亞急性衰老模型，以大鼠卵巢為研究對象，應(yīng)用RTPCR、Western blotting方法檢測并分析應(yīng)用六味地黃湯對衰老大鼠卵巢組織p16、p19ARF、Rb表達的影響，探討六味地黃湯在衰老途徑中抗鼠性腺衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用清潔級8周齡雌性SD大鼠75只，體重180～220 g(購自河北醫(yī)科大學實驗動物學部，合格證編號：605106)。根據(jù)實驗?zāi)康暮鸵髮D大鼠隨機分為以下各組，正常對照組、模型組、六味地黃湯組、VE陽性對照組，每組15只。

1.2 動物模型的建立和4組動物的處理 用D-半乳糖連續(xù)腹腔注射建立亞急性衰老動物模型：用0.9%氯化鈉溶液配成6%的溶液，按300 mg·kg-1·d-1給藥，連續(xù)60 d，1 次/d。六味地黃湯組和陽性對照組大鼠在造模的同時每天灌胃六味地黃湯、維生素E，連續(xù)60 d。

1.3 藥物溶液的制備 六味地黃湯方劑組成：熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉等，按重量比 8∶4∶4∶3∶3∶3比例混合，剪碎，水浸泡1 h，然后水煎2次，30 min/次，過濾后濃縮至含生藥為1 g/ml。4℃保存，給藥前復(fù)溫至25～30℃。維生素E溶液：用0.5%羧甲基纖維素鈉稀釋為含維生素 E 0.0055 g/ml藥液。4℃保存，給藥前復(fù)溫至25～30℃。

1.4 方法

1.4.1 設(shè)備與試劑：D-半乳糖購于北京化學試劑公司;TUNEL試劑盒購自Roche生物試劑公司;β-Actin單克隆抗體購自美國SANTA CRUZ公司;PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供;PCR儀(美國MJResearch公司);羊抗Rb多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司;Gel-Pro Analyzer 4.0電泳圖像定量分析系統(tǒng)購自美國media cybernetics公司。

1.4.2 RT-PCR的檢測：總RNA的提取按Trizol Reagent說明書進行。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。見表1。

表1 RT-PCR分析的引物

PCR過程：以總RNA為模板，以O(shè)ligo(dT)16為引物，按AMV(Promega)說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，加入p53 cDNA上、下游引物，以 β-actin為內(nèi)參照，進行 PCR。PCR擴增反應(yīng)體系：取5μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，依次加入 dNTPs混合物(終濃度 0.2 mmol/L)，MgCl22.5 mmol/L，上、下游引物(終濃度50 pmol/L)，10×PCR緩沖液2.5μl，Taq DNA聚合酶2 U，加無菌去離子水至總體積25μl，置PCR儀上進行擴增。設(shè)定反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 30 s，50℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，30 個循環(huán)后，72℃延伸7 min。最后取10μl PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，運用凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行吸光光度值分析。以p53/β-actin平均吸光度比值表示p53的mRNA水平，進行半定量分析。

1.4.3 Rb蛋白含量的檢測：大鼠斷頭處死，取出垂體、卵巢組織迅速投入液氮中，待用。卵巢細胞Rb蛋白提取及Western Bloting法檢測各組大鼠卵巢Rb蛋白的檢測，將組織從液氮中取出，研磨器中加入少許細胞裂解液(0.15 mol/L，NaCl，5 mmol/L，EDTA，1%TritonX-100，10 mmol/L，pH 值 7.4 Tris-HCl，1∶1 000 的 5 mol/L DTT，1∶1000 的100 mmol/L PMSF)，將組織研磨成漿后離心取上清。用蛋白定量測定試劑盒進行總蛋白測定，獲得每個組織的總蛋白濃度。電泳分離蛋白。用TBST清洗PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，分別加入Rb、β-actin等抗體(抗體稀釋度1∶200 ～1∶500)，搖床常溫孵育1 h，4℃過夜，TBST清洗，15 min/次，3次;加入過氧化物酶標記的二抗，(用含2.5%脫脂奶粉的TBST稀釋，稀釋度為1∶1 000)，搖床常溫孵育1 h，TBST清洗，5 min/次，3次。在PVDF膜上滴加酶的作用底物ECL，作用3 min后濾紙吸干，塑料保鮮膜包裹后放入暗匣，壓X光底片曝光2～5 min，顯影，定影。將清晰的條帶掃描后輸入圖像分析系統(tǒng)，結(jié)果以Rb/β-actin的OD比值表示。

1.5 統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用One-Way ANOAY方差分析，均數(shù)間兩兩比較進行SNK法Q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果 在正常大鼠卵巢組織中，p53、p19ARF、Rb、p16基因表達較低，模型組大鼠卵巢組織內(nèi)p53、p19ARF、Rb、p16表達上調(diào)(P＜0.05)，給予六味地黃湯治療后可以降低其表達(P ＜0.05)。見表1。

表1 各基因mRNA在大鼠卵巢組織中轉(zhuǎn)錄水平的分析結(jié)果n=15，±s

表1 各基因mRNA在大鼠卵巢組織中轉(zhuǎn)錄水平的分析結(jié)果n=15，±s

注：與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

六味地黃湯組 0.39±0.04# 0.59±0.01# 0.62±0.06# 0.75±0.012#VE陰性對照組 1.90±0.07*# 0.65±0.05*# 0.80±0.01*#1.05±0.21*#

2.2 Westernbloting結(jié)果 在正常大鼠卵巢組織中，Rb蛋白表達較低，模型組大鼠卵巢組織內(nèi) Rb蛋白表達上調(diào)(P＜0.05)，給予六味地黃湯治療后可以降低明顯其表達(P＜0.05)。見表2。

表2 Rb蛋白在大鼠卵巢組織中表達水平的分析結(jié)果±s

表2 Rb蛋白在大鼠卵巢組織中表達水平的分析結(jié)果±s

注：與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

模型組六味地黃湯組 0.59±0.16#VE陽性對照組 0.81±0.31*#

3 討論

p53基因是一種抑癌基因，亦是衰老基因，在p53衰老途徑中，p19ARF是p53的正性調(diào)節(jié)因子，p19ARF蛋白可以抑制MDM2的活性，使其不能介導(dǎo)p53的降解，從而激活p53，而高度活化的p53促進細胞衰老［5］。在調(diào)控細胞老化的Rb途徑中，p16、Rb基因的表達及功能的改變是細胞周期停滯的根本原因。Rb蛋白以其不同的活性狀態(tài)調(diào)控著細胞G1-S調(diào)控點，決定細胞增殖或進入生長停滯。p16蛋白是一種細胞周期抑制蛋白，可以阻斷CDK4-6途徑對Rb蛋白的磷酸化，非磷酸化的Rb蛋白與轉(zhuǎn)錄因子E2F相結(jié)合，阻止細胞進入S期，使細胞周期停滯，Rb與p16相互作用，影響著細胞的衰老［6］。這兩條衰老途徑中任何一條途徑活化均可以導(dǎo)致細胞衰老，但兩條途徑間存在著廣泛的多層次的聯(lián)系，常常共同參與細胞衰老過程。

本研究結(jié)果顯示：D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠卵巢組織p53、p19ARF、Rb以及p16基因表達明顯比正常組上調(diào)，說明衰老模型大鼠的卵巢組織表達衰老信號。應(yīng)用六味地黃湯后，大鼠卵巢組織的p53、p19ARF、Rb以及p16的表達均下降，因此推測p19ARF/p53/p21Cip1和p16INK4a/Rb兩條衰老途徑在大鼠卵巢組織衰老的過程中可能均發(fā)揮重要的作用。

綜上所述，六味地黃湯不僅在基因水平抑制了大鼠卵巢的衰老，而且這種抑制作用也表現(xiàn)在分子水平。六味地黃湯是通過抑制兩條衰老途徑中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，繼而可能抑制了衰老信號進一步向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而起到抗衰老的作用。因此，六味地黃湯是一種具有良好應(yīng)用前景的抗衰老藥物。

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