乳腺癌淋巴管密度的臨床病理意義

張?jiān)坪?王小玲

淋巴道轉(zhuǎn)移是癌癥的主要死亡原因之一，它是預(yù)后不良的重要危險(xiǎn)因素，也是確定治療方案和手術(shù)方式的重要指標(biāo)。乳腺癌是我國(guó)女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，淋巴管是乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到腋窩淋巴結(jié)的主要途徑。淋巴管和血管伴行生長(zhǎng)，但在結(jié)構(gòu)和功能方面卻有著明顯不同，以前對(duì)腫瘤淋巴管的研究由于缺乏特異性的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物而遠(yuǎn)滯后于對(duì)腫瘤血管的研究。新近發(fā)現(xiàn)的抗M2A的單克隆抗體D2-40能高度特異性的標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞［1，2］。本文通過(guò)免疫組化法研究D2-40標(biāo)記的乳腺癌淋巴管的病理學(xué)特征，定量分析D2-40陽(yáng)性微淋巴管密度，探討其在乳腺癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移中的臨床意義及其與其他病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集衡水市第二人民醫(yī)院2008年5月至2011年8月乳腺癌患者術(shù)后組織石蠟標(biāo)本50例，另選取同期乳腺纖維腺瘤標(biāo)本30例作為對(duì)照組?；颊呔鶠榕?，年齡28～78歲，中位年齡45歲。50例中，其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌41例，浸潤(rùn)性小葉癌6例，導(dǎo)管內(nèi)癌2例，黏液腺癌1例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的30例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的20例。腫瘤直徑0.6～8 cm，平均2.6 cm。病理分級(jí)：Ⅱ級(jí)7例，Ⅱ～Ⅲ級(jí)22例，Ⅲ級(jí)12例。臨床分期：Ⅰ期的8例，ⅡA期的22例，ⅡB期的17例，ⅢA期的3例。所有病例術(shù)前均未接受放化療，均有完整的臨床病理資料。

1.2 試劑及免疫組化方法 主要試劑鼠抗人D2-40免疫組化單克隆抗體，金·多聚賴氨酸粘附玻片，UltrasensitiveTMSP超敏試劑盒(鼠/兔)，DAB顯色試劑盒，PBS磷酸鹽緩沖液(粉劑);檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(粉劑)均由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。免疫組化方法：石蠟切片4μm厚，放入烤箱烤蠟3 h;常規(guī)二甲苯、梯度酒精脫蠟至水;檸檬酸鹽抗原修復(fù)液高溫修復(fù);切片依次滴加過(guò)氧化物酶阻斷試劑，正常非免疫動(dòng)物血清，第一抗體D2-40，生物素標(biāo)記的第二抗體，鏈霉素抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶試劑;切片上滴加新鮮配制的DAB顯色試劑顯色;自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷 D2-40特異性的定位于淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞，以胞漿或胞膜呈現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。D2-40標(biāo)記的微淋巴管密度的判定采用Fox等［3］報(bào)道的方法先在低倍鏡下(×100)選取脈管數(shù)目最多的2個(gè)“熱點(diǎn)”，然后在高倍鏡(×400)下觀察每個(gè)熱點(diǎn)的5個(gè)視野，計(jì)數(shù)其脈管數(shù)目，但應(yīng)除外管腔直徑＞8個(gè)紅細(xì)胞或管壁有平滑肌存在的脈管，最后再計(jì)算2個(gè)熱點(diǎn)，5個(gè)視野的平均脈管數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間計(jì)量資料均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用person相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D2-40標(biāo)記的良惡性乳腺組織中的淋巴管形態(tài)特征及分布 D2-40陽(yáng)性的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿或胞膜內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒。光鏡下D2-40染色陽(yáng)性的淋巴管具有不規(guī)則形狀，由單層內(nèi)皮細(xì)胞排列而成，有空隙，無(wú)厚壁結(jié)構(gòu)，管腔中無(wú)紅細(xì)胞。乳腺癌癌周組織內(nèi)淋巴管較豐富，管壁薄，管腔扁大(圖1)，可有較多皺褶，可見(jiàn)脈管瘤栓(圖2);周圍乳腺組織內(nèi)淋巴管也較多，管壁也很薄，管腔大且擴(kuò)張(圖3);乳腺癌中心區(qū)淋巴管少且小，管腔狹窄(圖4)，甚至呈條索狀，發(fā)育差;乳腺纖維腺瘤中的淋巴管也少，管腔狹小(圖5)，乳腺肌上皮細(xì)胞D2-40也呈陽(yáng)性表達(dá)(圖6)。

圖1 乳腺癌癌周組織內(nèi)淋巴管豐富，管壁薄，管腔扁大(SP×100)

圖2 乳腺癌癌周組織內(nèi)淋巴管扁大擴(kuò)張，可見(jiàn)脈管瘤栓管(SP×100)

圖3 周圍乳腺組織內(nèi)淋巴管豐富，管壁薄，管腔大且擴(kuò)張(SP×100)

圖4 乳腺癌中心區(qū)淋巴管數(shù)量少，管腔小且狹窄，其中一管腔內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞(SP×100)

圖5 乳腺纖維腺瘤中淋巴管數(shù)量少，管腔狹小(SP×40)

圖6 乳腺纖維腺瘤中導(dǎo)管肌上皮細(xì)胞D2-40染色陽(yáng)性(SP×40)

2.2 乳腺癌癌周、乳腺周圍及中心區(qū)的微淋巴管密度比較50例乳腺癌中有38例D2-40陽(yáng)性，30例乳腺纖維腺瘤中有10例D2-40陽(yáng)性，2組陽(yáng)性率(38/50，10/30)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=3.241，P＜0.05)。乳腺癌癌周組織微淋巴管密度為8.60～33.50個(gè)，平均(21±6)個(gè);乳腺癌中心區(qū)微淋巴管密度為4.20～13.67個(gè)，平均(6±4)個(gè);周圍乳腺組織微淋巴管密度為7.13～25.80個(gè)，平均(17±8)個(gè);乳腺纖維腺瘤微淋巴管密度為5.30～12.50個(gè)，平均為(7.2±2.4)個(gè)。乳腺癌癌周區(qū)微淋巴管密度明顯高于中心區(qū)和纖維腺瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.09，P ＜0.05;t=12.01，P ＜0.05)。周圍乳腺組織的微淋巴管密度明顯高于中心區(qū)和纖維腺瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.67，P ＜0.05;t=10.23，P ＜0.05)。乳腺癌癌周的微淋巴管密度明顯高于周圍正常乳腺組織的微淋巴管密度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.92，P＜0.05)。乳腺癌中心區(qū)的微淋巴管密度和乳腺纖維腺瘤組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.704，P=0.488)。

2.3 乳腺癌癌周、周圍乳腺及中心區(qū)的微淋巴管密度與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性 乳腺癌癌周和周圍乳腺組織的微淋巴管密度與腫瘤的大小，臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)(P ＜0.05)，與患者的年齡、組織學(xué)分型及 ER、PR、C-erbB2、Ki-67、VEGF、P53等臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性(P ＞0.05)。乳腺癌中心區(qū)的微淋巴管密度與這些臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性(P ＞0.05)。見(jiàn)表1～3。

3 討論

惡性腫瘤中血道和淋巴道轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要途徑，而腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲又是癌癥患者死亡的重要原因之一。乳腺癌早期以淋巴道轉(zhuǎn)移為主，因而對(duì)腫瘤淋巴管的研究也就顯得尤為重要。但由于缺少特異性的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，對(duì)腫瘤淋巴管的研究一直滯后于對(duì)腫瘤血管的研究。以前報(bào)道過(guò)的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-3(VEGFR-3)，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體-1(LYVE-1)，Podoplanin等［4］，但在以后的研究中發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記物的特異性都較差，因而制約了對(duì)腫瘤淋巴管的研究。新近發(fā)現(xiàn)的D2-40是一種抗M2A癌胚膜抗原的IgG2a型的鼠來(lái)源的單克隆抗體，其標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性和敏感性均高于其他的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物。目前大部分的研究結(jié)果證實(shí)了D2-40能高度特異的標(biāo)記正常和腫瘤組織中的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，可用于免疫組化檢測(cè)冷凍和石蠟包埋組織病理切片中的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，并且可以檢測(cè)多種惡性腫瘤的淋巴管侵襲［1，2］。

表1 乳腺癌癌周LMVD與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

表2 周圍乳腺組織LMVD與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

表3 乳腺癌中心區(qū)LMVD與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

本研究通過(guò)對(duì)50例乳腺癌和30例乳腺纖維腺瘤的微淋巴管的標(biāo)記和計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織周邊及離癌組織較遠(yuǎn)的正常乳腺組織內(nèi)都存在較多的淋巴管，且乳腺癌周邊的淋巴管密度較正常乳腺組織內(nèi)的淋巴管密度高。癌組織周邊及離乳腺癌組織較遠(yuǎn)的正常乳腺組織內(nèi)的淋巴管管壁薄，管腔扁且大，可見(jiàn)較多皺褶，乳腺癌中心區(qū)組織內(nèi)也存在一些淋巴管，但數(shù)量很少且管腔小，發(fā)育差，有的甚至閉鎖呈條索狀，這與一些學(xué)者的觀點(diǎn)是一致的［5］。乳腺纖維腺瘤組織中也存在一些淋巴管，但數(shù)量遠(yuǎn)較乳腺癌周邊及離乳腺癌組織較遠(yuǎn)的正常乳腺組織內(nèi)的少，且管腔小，與文獻(xiàn)報(bào)道［6］一致。同時(shí)在研究微淋巴管密度與乳腺癌組臨床病理參數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)乳腺癌周邊及周圍乳腺組織內(nèi)的微淋巴管密度和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況，腫物的大小，臨床分期密切相關(guān)，而與患者的年齡、組織學(xué)分型及 ER、PR、C-erbB2、Ki-67，VEGF，P53等臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性，可能與標(biāo)本量較小有關(guān)。

乳腺癌在早期是以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主的，在腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之前，它必須先進(jìn)入淋巴管。乳腺癌組織周邊及遠(yuǎn)離癌組織的正常乳腺組織中的淋巴管數(shù)目的增加可以增加淋巴管的表面積，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞更容易入侵，淋巴管數(shù)目的增加以及淋巴管腔的擴(kuò)張，又導(dǎo)致了淋巴管密度的增加，這可能是腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)及LMVD增加的機(jī)制［6］。淋巴管的增生及擴(kuò)張為癌細(xì)胞向淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移提供了便利的途徑，所以研究乳腺癌的淋巴管密度的臨床病理意義對(duì)探討淋巴管的生成機(jī)制具有一定的價(jià)值，并且可以對(duì)乳腺癌預(yù)后的判斷以及抗淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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