胚胎致死性異常視覺蛋白HuR在卵巢上皮性癌表達(dá)及預(yù)后

齊玉明 成艷梅 王振芬 李研 石彬

卵巢惡性腫瘤在女性生殖器官惡性腫瘤中的發(fā)生率占第三位，但其病死率卻居第一位。卵巢癌發(fā)病隱匿，70%的患者診斷明確時已是臨床晚期。雖然，多年來外科手術(shù)操作技術(shù)、化療方案不斷改進(jìn)，仍不能改善卵巢癌的生存率，5年生存率始終徘徊在30%左右。因此，尋找新的防治方法，提高患者5年的生存率是急需解決的問題。HuR是RNA結(jié)合蛋白中胚胎致死異常視覺(embryonic lethal abnormal vision，ELAV)家族的一員，ELAV家族是最緊密的RNA結(jié)合蛋白。HuR廣泛存在于幾乎所有的增殖細(xì)胞中，通過一定的信號途徑參與細(xì)胞的增殖、分化等多種細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)。人體內(nèi)有多種細(xì)胞可分泌HuR，但在一些正常組織中表達(dá)水平很低，而在許多惡性腫瘤組織中表達(dá)水平增高，且與預(yù)后不良有關(guān)。本研究旨在檢測HuR在卵巢上皮性癌的表達(dá)，對卵巢癌的防治提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2005年6月至2010年8月，在河北醫(yī)科大學(xué)第二學(xué)院婦科因卵巢上皮性癌而接受手術(shù)治療的患者68例，術(shù)前均未接受放療、化療、激素及免疫治療，術(shù)后病理組織學(xué)診斷明確，平均年齡52歲。按照WHO(1973)標(biāo)準(zhǔn)將研究對象進(jìn)行組織學(xué)分類及分級，其中包括漿液性囊腺癌44例，黏液性囊腺癌18例，子宮內(nèi)膜癌6例;病理分級：高分化10例，中分化30例，低分化28例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例;按照2000年FIGO臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期11例，Ⅱ期16例，Ⅲ期31例，Ⅳ期10例;選擇同期交界性卵巢腫瘤10例(漿液性6例和黏液性4例)和同期因其他原因行子宮+雙附件切除的正常卵巢5例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集：腫瘤切下后，從腫瘤生長活躍、無壞死的邊緣部位取下約1 cm3大小的組織2塊，放入100 mmol/L甲醛溶液固定、石蠟包埋，用于免疫組化測定。

1.2.2 免疫組化法檢測HuR的表達(dá)：標(biāo)本常規(guī)脫水，石蠟包埋并制成4μm厚的連續(xù)切片，經(jīng)HE染色判斷切片質(zhì)量后，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法，在同一時間、同一條件下進(jìn)行免疫組化檢測。兔抗人多克隆HuR抗體為Santa Cruz產(chǎn)品，兔SP免疫組化試劑盒、DAB試劑盒均購于北京中杉金橋試劑公司。染色步驟按SP試劑盒(北京中杉金橋試劑公司)說明書進(jìn)行，微波修復(fù)抗原，一抗滴度為1∶200。磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液代替一抗做陰性對照。取表達(dá)最強(qiáng)的部分，按著色程度分為基本未著色，染色與背景相似者為0分;著色淺，高于背景為1分;中度著色，明顯高于背景者為2分;強(qiáng)染，著色深棕黃色者為3分。隨機(jī)選取5個高倍視野，在400倍視野下連續(xù)記數(shù)100個細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)小于5%者為0，陽性細(xì)胞數(shù)5% ～25%計1分;26% ～50%計2分;51% ～75%計3分;76% ～100%計4分，兩種積分相加，積分為0～1分，表示陰性(-);積分為2～3分，表示陽性(+);積分為4～5分，表示陽性(++);積分為6～7分，表示陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，等級資料的組間比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織胞核中的表達(dá) 卵巢上皮性癌組織中胞核HuR的表達(dá)明顯高于交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織(P＜0.01);交界性卵巢腫瘤胞核HuR的表達(dá)與正常卵巢組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 3組HuR陽性表達(dá)率比較 例

2.2 胞質(zhì)HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中的表達(dá) 卵巢上皮性癌組織中胞質(zhì)HuR的表達(dá)明顯高于交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織(P＜0.05);胞質(zhì)HuR的表達(dá)在交界性卵巢腫瘤與正常卵巢組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表2。

表2 3組胞質(zhì)HuR陽性表達(dá)率比較 例

2.3 胞質(zhì)HuR的表達(dá)與卵巢上皮性癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 FIGO的臨床分期Ⅲ～Ⅳ期胞質(zhì)HuR的陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.05)。組織分化高的卵巢上皮性癌胞質(zhì)HuR的表達(dá)較中、低分化的表達(dá)弱(P＜0.05)，胞質(zhì)HuR的表達(dá)在中分化與低分化之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 胞質(zhì)HuR的表達(dá)與卵巢上皮性癌臨床病理學(xué)特征例(%)

3 討論

3.1 HuR在卵巢上皮性癌中表達(dá)的意義 HuR是RNA結(jié)合蛋白中胚胎致死異常視覺(embryonic lethal abnormal vision，ELAV)家庭的一員，又稱為類胚胎致死異常視覺蛋白 A。ELAV家庭是最緊密的RNA結(jié)合蛋白，最初是在果蠅中被發(fā)現(xiàn)。ELAV家庭共包括四個成員：HuD、HuC、Hel-N1(HuB)和HuR。HuR幾乎在所有增殖的細(xì)胞中表達(dá)，而其他三個成員主要表達(dá)在終端分化的神經(jīng)組織中。

HuR分子量為36 kD，許多早期反應(yīng)基因的mRNAs在其3’非翻譯區(qū)(untranslated regins，UTR)有AU富含元件(AU-rich elements，AREs)，可以與順式反應(yīng)元件一起調(diào)節(jié)mRNAs的不穩(wěn)定性。HuR可以與 AREs相互作用，AREs在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化以及免疫應(yīng)答基因的表達(dá)中起關(guān)鍵作用，編碼細(xì)胞因子、淋巴因子及原癌基因的一類早期反應(yīng)基因的mRNA均含有ARE，其mRNA通常在細(xì)胞外刺激的條件下短期轉(zhuǎn)錄，然后被迅速從細(xì)胞質(zhì)清除。這類基因通常是即刻進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合的這種基因表達(dá)調(diào)控步驟，對于精確調(diào)控潛在有害的致炎因子和轉(zhuǎn)化因子有重要作用。目前，許多ARE結(jié)合蛋白被識別，HuR是其中一種。Nowotarski等［1］報道HuR的過表達(dá)不是增強(qiáng)mRNA降解，而是在瞬時轉(zhuǎn)染實驗中穩(wěn)定mRNA。并且在轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞后穩(wěn)定包含AREs的mRNAs并使之過表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，HuR即可在胞核表達(dá)，也可在胞質(zhì)表達(dá)。胞核HuR的表達(dá)在正常卵巢組織、交界性卵巢腫瘤組織和卵巢上皮性癌中陽性表達(dá)率呈遞增趨勢，且在卵巢上皮性癌中的表達(dá)明顯高于交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織，而在交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。胞質(zhì)HuR的表達(dá)在正常卵巢組織、交界性卵巢腫瘤組織和卵巢上皮性癌中陽性表達(dá)率也呈遞增趨勢，且卵巢上皮性癌中的表達(dá)與交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而在交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示，HuR的異常表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生有密切關(guān)系。

3.2 HuR在胞質(zhì)和胞核的表達(dá)及與臨床指標(biāo)的關(guān)系 近來研究表明HuR可以在核質(zhì)間穿梭［2］。Hu蛋白含有3個保守的RNA識別模序(RNA recognition motifs，RRMs)，在 RRM2 和RRM3之間有鉸鏈區(qū)，該區(qū)內(nèi)含一段包含52個氨基酸的HuR核質(zhì)穿梭(HuR nucleocytoplasmic shuttling，HNS)區(qū)，對細(xì)胞定位和功能相當(dāng)重要。可以先與包含ARE的mRNAs在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合，然后與之一起進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，保護(hù)mRNAs避免其衰變降解，從而導(dǎo)致HuR在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)。Jie等［3］研究表明HuR可以通過2種不同途徑進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。一種是需要4種蛋白配體(PP32，SETa，SETb和APRL)的依賴染色體區(qū)域維持蛋白質(zhì)(chromosomal region maintenance protein1，CRM1)，另一種是非依賴CRM1而需要HNS，正是通過上述兩種機(jī)制，使HuR在核與質(zhì)間穿梭，從而使HuR在胞核與胞質(zhì)均有表達(dá)。但是，許多研究發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)HuR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)和預(yù)后有關(guān)，未發(fā)現(xiàn)胞核HuR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)和預(yù)后有關(guān)［4］。

本研究選擇了與卵巢上皮性癌關(guān)系最密切的五個臨床參數(shù)，分別是患者年齡、FIGO分期、病理類型、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果顯示，胞質(zhì)HuR的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級和臨床分期有關(guān)。胞質(zhì)HuR在組織學(xué)分級1級(高分化)、2級(中分化)、3級(低分化)的陽性表達(dá)率分別為：10.00%、46.67%、57.14%，呈遞增趨勢，組織分化高的卵巢上皮性癌組織中胞質(zhì)HuR的表達(dá)同中-低分化組的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。FIGO臨床分期晚期(Ⅲ+Ⅳ期)患者胞質(zhì)HuR的陽性表達(dá)率(56.09%)顯著高于早期(Ⅰ+Ⅱ期)患者(29.63%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。本研究未發(fā)現(xiàn)胞核HuR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)存在相關(guān)性。這與Erkinheimo等［5］報道的結(jié)果基本一致。作為 mRNA穩(wěn)定因子的HuR蛋白在腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)分布有其特殊的意義。推測胞質(zhì)HuR的分布與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。對于其胞質(zhì)分布的機(jī)制，有待進(jìn)一步的研究。提示惡性程度越高，臨床分期越晚，卵巢癌組織中胞質(zhì)HuR的表達(dá)越強(qiáng)。

本研究未發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)HuR的表達(dá)與患者發(fā)病年齡與病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這與有的學(xué)者報道不相同。Denkert等［6］報道胞質(zhì)HuR的表達(dá)與卵巢癌年齡有關(guān)，與病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。Mrena等［7］報道，胞質(zhì)HuR的表達(dá)與胃癌的發(fā)病年齡、性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。可能與胞質(zhì)HuR在不同腫瘤細(xì)胞分布不同和本實驗中樣本例數(shù)相對較少，造成實驗誤差有關(guān)，有待于增加樣本例數(shù)，改進(jìn)實驗方法進(jìn)一步證實。

已發(fā)現(xiàn)許多基因的mRNA可以與HuR結(jié)合，例如：COX-2、血管源性生長因子(如VEGF)、和免疫抑制細(xì)胞因子(如TGF、IL-6)等，均可促進(jìn)腫瘤生長［8］。Grau 等［9］報道，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤中，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)RNA轉(zhuǎn)錄子的穩(wěn)定對于其表達(dá)上調(diào)是一種重要的分子途經(jīng)，而HuR對上述基因具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。提示，如果成功抑制HuR對上述基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，有可能抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。

根據(jù)HuR蛋白在惡性腫瘤中的過表達(dá)和它的生物學(xué)功能，HuR蛋白抑制劑可對抗腫瘤致炎因子血管生成和腫瘤增殖，推測HuR抑制劑有望成為腫瘤分子治療的新靶點。目前，抑制HuR的RNA介導(dǎo)的治療已用于臨床［10］，我們期待在這一領(lǐng)域的研究能夠更加深入。

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