凝乳酶在干酪生產中的應用

文 / 劉顯庭 張 昊 郭慧媛 任發(fā)政

（中國農業(yè)大學教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室）

干酪是以乳、稀奶油、脫脂乳或部分脫脂乳、酪乳或這些原料的混合物為原料，經凝乳并排出乳清而制成的新鮮或發(fā)酵成熟的乳制品。按不同的凝乳方式，干酪可分為酶凝型干酪與酸凝型干酪。目前，大部分干酪屬于酶凝型干酪，即通過凝乳酶的作用促進凝乳的形成。凝乳酶的作用關系到干酪品質的好壞與干酪生產的經濟效益，在干酪生產中的作用至關重要。目前，隨著干酪產量的快速增長，傳統(tǒng)的小牛皺胃凝乳酶的生產已經處于供不應求的狀態(tài)，探尋新來源凝乳酶成為了目前研究的熱點。

1 凝乳酶概述

凝乳酶在干酪生產中的使用可以追溯到約公元前6000年，舊石器時代的人們用小牛的皺胃作為容器盛裝牛乳的過程中發(fā)現(xiàn)牛乳凝集現(xiàn)象，從而使得皺胃凝乳酶在干酪生產中的應用成為了可能[1]。凝乳酶按來源可分為動物性凝乳酶、植物性凝乳酶、微生物凝乳酶、基因工程重組凝乳酶四類。

動物性凝乳酶是一類傳統(tǒng)的凝乳酶，主要從新生反芻動物如小牛的第四個胃即皺胃中提取。目前，由于小牛皺胃酶等動物性凝乳酶在干酪生產中得到廣泛地應用，從反芻動物中獲取小牛皺胃酶等動物性凝乳酶已經實現(xiàn)大規(guī)模生產[2]。一般從新生小牛皺胃中提取的皺胃酶由凝乳酶（EC 3.4.23.4）及部分胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）、胃蛋白酶B（EC 3.4.23.2）、胃亞蛋白酶（EC 3.4.23.3）組成，這類酶都屬于天冬氨酸蛋白酶（EC 3.4.23）。皺胃酶包含凝乳酶與胃蛋白酶，其比例受小牛生長期、飼養(yǎng)情況影響，在飼養(yǎng)條件良好的情況下小牛皺胃中凝乳酶所占的比例可大于80%[3]。目前生產用皺胃酶中凝乳酶的比例在50%～90%。凝乳酶能特異性水解Κ-酪蛋白產生酪蛋白巨肽，從而形成凝乳，而胃蛋白酶的水解特性并不專一，它能同時水解含有Phe，Tyr，Leu，Val的肽鍵[4]。動物凝乳酶的凝乳活力與蛋白水解能力高，是目前干酪生產中首選的凝乳酶，但是隨著世界干酪產業(yè)不斷發(fā)展壯大，通過宰殺犢牛以獲得凝乳酶的方法已經無法滿足生產的需要，因此亟待開發(fā)新來源的凝乳酶。植物性凝乳酶、微生物凝乳酶、基因工程重組凝乳酶都屬于新來源凝乳酶。

植物性凝乳酶是從植物的組織中水浸提取出的一類具有凝乳作用的蛋白酶，目前被廣泛認為具有替代傳統(tǒng)凝乳酶的潛力。常見的從無花果樹類中提取的蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等植物性凝乳酶的蛋白水解能力較弱，不能應用于干酪生產中[5]。但是少數植物性凝乳酶在干酪生產中的應用已經較為廣泛，如地中海大薊，其在傳統(tǒng)干酪生產中的應用已有數世紀的歷史[6]。

微生物凝乳酶是微生物代謝作用產生的一類具有凝乳作用的蛋白酶，能部分應用于生產中。與傳統(tǒng)的皺胃酶相比，微生物凝乳酶的生產周期短，產量大，受氣候、地域、時間限制小，用其生產凝乳酶成本較低。同時，由于宗教信仰的原因，微生物凝乳酶生產的干酪更受素食主義者的青睞。目前微生物凝乳酶的主要來源是米黑根毛霉，其作為動物性凝乳酶的替代已長達40 年。隨著分離與純化技術的提高，此類凝乳酶已為素食主義者所接受并應用于有機干酪的生產中。但是微生物凝乳酶對蛋白酶的高降解能力易導致干酪的產率下降。

基因工程重組凝乳酶一般表示為發(fā)酵生產凝乳酶（FPC），是利用基因重組技術生產的一類具有凝乳作用的蛋白酶。自1990年利用重組DNA技術發(fā)酵生產凝乳酶的方法得到美國FDA認證以來，基因工程發(fā)酵生產凝乳酶在美國廣泛應用并在世界范圍內逐漸被接受，2006年發(fā)酵生產凝乳酶市場份額占有70%～80%[7]。但是，基于安全的考慮，此類凝乳酶生產的干酪仍然不被部分消費者所接受。

由于受反芻動物種類、年齡、飼養(yǎng)等的影響，凝乳酶的理化性質往往不恒定，而在一定的范圍內。如表1所示，凝乳酶的分子量在31～40 kDa之間，其活性同時受pH值和溫度等的影響。研究表明，凝乳酶在pH值5.5～6.0下最為穩(wěn)定，在pH值 3～4之間，凝乳酶自動降解而迅速失活，在pH值>9.8時凝乳酶則發(fā)生不可逆轉的結構變化而失去活性。當凝乳酶所處溫度從45 ℃升到55 ℃時活性迅速降低，當溫度達到55 ℃時凝乳酶活性即喪失。凝乳酶性質的差異影響了干酪的品質，因此應當對不同類凝乳酶的成分進行測定，對其凝乳活力標準化，以供干酪生產中參數的調整。

表1 動物性凝乳酶中蛋白酶的主要特征

2 凝乳酶在干酪生產中的作用

2.1 凝乳酶促進凝乳的形成

凝乳酶在促進凝乳過程中的主要作用對象是酪蛋白。酪蛋白約占牛乳中蛋白質含量的 80%，可分為 αs1、αs2、β 和 Κ-酪蛋白，其質量比約為 4︰1︰4︰1.3[14]。牛乳中這四種酪蛋白單體會與磷酸鈣相互結合成直徑約為100～300 nm的膠束結構[15～16]。目前，關于酪蛋白膠束的結構尚無定論，但是大都認為其由疏水性的αs-酪蛋白、β-酪蛋白構成了膠束內部，由親水性的Κ-酪蛋白組成其外部。其中，αs-酪蛋白、β-酪蛋白帶有多個磷酸根基團對Ca2+敏感，能與Ca2+橋接形成穩(wěn)定的內部結構，而Κ-酪蛋白只有一個磷酸根基團，并使Ca2+橋接終止，形成穩(wěn)定的毛發(fā)層結構。同時，毛發(fā)層的Κ-酪蛋白由副Κ-酪蛋白與帶有負電的酪蛋白巨肽組成，從而使膠束表面帶有負電荷。酪蛋白膠束之間通過膠束間毛發(fā)層的空間位阻作用與靜電斥力而穩(wěn)定存在于牛乳中。

在凝乳的過程中，通過凝乳酶的作用可以破壞原本穩(wěn)定的酪蛋白膠束結構，使得膠束之間發(fā)生聚集而形成凝乳。凝乳酶對酪蛋白膠束的作用在于特異性的作用于Κ-酪蛋白的第105～106 位的肽鍵位點，水解Κ-酪蛋白成酪蛋白糖巨肽與副Κ-酪蛋白。隨著帶負電的酪蛋白糖巨肽釋放至乳清，酪蛋白膠束表面的負電荷減少，膠束間的靜電斥力下降，毛發(fā)層切除致膠束間的空間位阻降低。最終，酪蛋白通過疏水鍵合與Ca2+架橋作用聚集，從而形成凝乳[17]。

不同類的凝乳酶由于水解酪蛋白的能力有所不同，所以凝乳酶作用形成凝乳的時間不同，達到切割時所需彈性模量值的凝乳酶量也不同。Kappeler等人利用基因重組技術合成的一類多肽的活性是傳統(tǒng)凝乳酶活性的兩倍，所需凝乳時間短，酶量少。因此，為使生產工藝標準化，必須根據凝乳酶的活力對凝乳酶的使用量進行適當的調整。凝乳酶的活力是指凝乳酶分解Κ-酪蛋白的能力，是凝乳酶最重要的性質之一。傳統(tǒng)的凝乳酶活力測試方法為Soxhlet法，即35 ℃下一體積凝乳酶溶液在40 min內使牛乳形成凝乳的體積[18]。目前，針對山羊凝乳酶、小牛凝乳酶與微生物凝乳酶，已經分別建立ISO/IDF199、ISO/IDF157 、ISO/IDF176等凝乳酶活力的測定標準。在32 ℃、pH值6.5下，將牛乳標準化后作為作用基質，測定凝乳酶與標準蛋白酶的凝乳活力并進行比較，凝乳酶的活力單位表示為國際凝乳活力單位（IMCU）。最近的研究中，Cortellino等人利用高效液相色譜法分離了小牛皺胃酶中的胃蛋白酶與凝乳酶，并測定了其活力。其結果與IDF標準使用的方法比較并無差異，說明IDF標準所使用的方法可靠、簡便、迅速，能準確地反映出凝乳酶的活力[19]。

2.2 凝乳酶對干酪成熟期蛋白水解的影響

除促進凝乳形成外，凝乳酶對于干酪獨特風味的形成有著重要的作用。在凝乳形成后，大部分凝乳酶會隨著乳清而排出，而只有少量的凝乳酶殘留在凝塊當中，凝塊當中凝乳酶的量受凝乳酶種類、排乳清時溫度、pH值及凝塊水分的影響，在0%～30%范圍內[20]。在干酪的成熟期，隨著pH值與NaCl濃度的變化，殘留的凝乳酶會作用于αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白的多個鍵位，使其分解形成短肽與氨基酸。目前有關凝乳酶如何影響干酪成熟期的報道較多，其共同表明凝乳酶主要在成熟的早期起作用[21～22]。有研究表明，將凝塊加熱至45～60 ℃后，干酪成熟期的αs-酪蛋白降解明顯減少，說明凝乳酶加速了αs-酪蛋白的降解[23]。Hynes等人的研究表明，αs-酪蛋白的降解速度與凝乳酶的使用量直接相關，且αs-酪蛋白對于軟質奶酪特征風味與質構具有很大作用，而在硬質或半硬質干酪的生產中，殘留凝乳酶的活力多由凝塊的加熱溫度決定[24]。

凝乳酶的種類影響了干酪風味的形成，2009年Bansal的研究表明，基因工程凝乳酶與小牛皺胃凝乳酶相比，二者在組分與產品pH值上無差異，而在αs-酪蛋白的降解上，小牛皺胃酶的苦味、硫磺味較弱[25]。即使同屬于動物性的凝乳酶也存在著明顯差異，2004年Prieto用小山羊皺胃凝乳酶替代小牛皺胃凝乳酶，其結果表明αs-酪蛋白的降解明顯減弱，成熟過程中干酪三氯乙酸可溶性氮含量的增加延遲[26]。因此，凝乳酶的種類、成分對干酪成熟期蛋白質的分解有顯著的影響。

由于部分凝乳酶特別是糊狀凝乳酶中還含有脂肪酶等，因此還能分解乳脂肪產生游離脂肪酸。有研究表明，在部分意大利干酪如菠蘿伏洛干酪、佩科里諾干酪的生產中，在脂肪分解酶的作用下形成了干酪的特征性風味[27]。Virto等人發(fā)現(xiàn)在羔羊皺胃酶內的脂肪分解酶作用下，脂肪分解產生游離脂肪酸，從而形成了干酪銳利、辛辣的風味[28]，并使游離氨基酸的釋放延遲[29]。這種脂肪酶包含前胃酯酶與胃酯酶，其活性與羔羊的飼養(yǎng)等因素有關，有研究指出在飼料中加入益生菌后，從羔羊皺胃中提取的糊狀凝乳酶中脂肪酶的活性增高[30～31]。

3 凝乳酶在干酪生產中的應用現(xiàn)狀

聯(lián)合國糧農組織的數據顯示，1961～2010年期間，世界干酪生產量平均年增長率達3.5%，高增長的干酪需要更多的凝乳酶。但是由于新生小牛皺胃數量有限，使得目前凝乳酶的生產供不應求，小牛皺胃凝乳酶僅能滿足凝乳酶的需求量的20%～30%[32]，約80%的小牛皺胃酶用于傳統(tǒng)干酪的生產中。最近幾年來，對于其它反芻動物皺胃酶尤其是小羊皺胃酶的研究逐漸成為熱點，但一直未商業(yè)化生產。有研究在具有原產地保護的意大利菠蘿伏洛干酪中使用小羊皺胃酶，其結果表明，由于小羊皺胃酶含有脂肪分解酶從而分解脂肪產生游離脂肪酸，使干酪形成銳利、辛辣刺激的風味[33]。因此，盡管傳統(tǒng)的動物性凝乳酶在市場上供不應求，但是由于不同類的凝乳酶作用不同，特別是對于形成特征性風味的作用有差異，消費者習慣了傳統(tǒng)干酪的風味而不能接受這類酶在干酪中應用。因此，有些傳統(tǒng)的凝乳酶在有原產地保護標志干酪的生產中仍具有不可替代的作用。

然而在我國由于干酪產業(yè)的起步較低，目前生產重心主要停留在再制干酪加工與進口產品的分裝上，且傳統(tǒng)干酪如云南乳扇、廣東姜撞奶等屬于酸凝型干酪，對凝乳酶的需求量較小。因此，凝乳酶在我國尚未實現(xiàn)產業(yè)化生產。但是隨著我國奶業(yè)的高速發(fā)展與乳制品生產結構的調整，干酪已經成為中國乳品產業(yè)研究開發(fā)的熱點及新的消費增長點。而凝乳酶作為干酪生產用的酶制劑，在干酪生產的帶動下也必將成為我國研發(fā)與生產的重點之一。

4 小結與展望

凝乳酶對于干酪的生產至關重要，凝乳酶是食品工業(yè)中最為重要的蛋白酶。在目前凝乳酶短缺的情況下，為開發(fā)具有高凝乳活力，低蛋白水解力的凝乳酶，亟待開展有關新來源凝乳酶在促進凝乳形成，促進干酪獨特風味形成中作用的研究。同時，隨著研究的不斷深入，在原產地保護干酪生產之外，發(fā)酵生產凝乳酶的應用必將成為今后產業(yè)發(fā)展的新方向，也必將對干酪產業(yè)產生巨大的經濟效益。

【基金支持：“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD12B08，2011AA100903）】

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