雞場土壤中大腸桿菌的檢測與化學(xué)消毒劑篩選

趙 月，畢丁仁，* ，李自力，* ，王振豹，崔惠娟，高小聰，于 洋，周祖濤，劉 梅，，金 卉，，王香萍

(1．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070;2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，武漢 430070)

近年來，畜禽舍氣源性傳染病的爆發(fā)流行以及畜禽糞便隨意排泄導(dǎo)致的土壤污染問題日益嚴(yán)重，不僅給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失，而且威脅公民的健康和公共安全［1－3］。養(yǎng)殖場周圍的土壤環(huán)境污染問題越來越受到人們的關(guān)注，土壤一旦被污染，其組成和理化性質(zhì)等均會發(fā)生變化。不僅破壞其自身的正常功能，而且可通過土壤中病原菌的進一步擴散等過程對地下水造成污染以致對人體健康構(gòu)成危害［4－6］。因此，養(yǎng)殖場污染土壤的治理與修復(fù)就顯得至關(guān)重要，土壤治理仍成為當(dāng)前面臨的一大難題［9－10］。雖然國內(nèi)外已有較多報道從不同方面對土壤中病原菌的控制進行了相關(guān)研究，且用于病原微生物的化學(xué)消毒劑種類也較多［7－8］，但針對被污染土壤的可大規(guī)模推廣應(yīng)用且對環(huán)境影響較小的消毒劑相關(guān)研究鮮有報道，本研究通過對湖北省部分地區(qū)雞場內(nèi)的污染土壤進行調(diào)查分析，了解土壤受污染情況，同時應(yīng)用戊二醛和二氧化氯消毒劑對雞場土壤所分離的大腸桿菌進行消毒試驗，為今后用于土壤治理的化學(xué)消毒劑的選擇使用提供依據(jù)。

1 材料

1．1 供試土樣 于2009～2010年采集于湖北省漢川、鐘祥、江夏等地養(yǎng)雞場雞舍附近土壤。

1．2 主要試劑 卵磷脂、25%戊二醛等，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂和各種微量生化反應(yīng)管，杭州微生物試劑有限公司;TSB、TSA培養(yǎng)基，BD公司。胰蛋白胨，酵母浸出物，OXOID公司;瓊脂粉，BIOSHARP公司。月桂基硫酸鹽胰蛋白培養(yǎng)基和煌綠乳糖膽鹽培養(yǎng)基，上海盛思生化科技有限公司;二氧化氯，湖南坤源股份有限公司。

2 方法

2．1 土壤中污染指標(biāo)的檢測方法

2．1．1 土壤中異養(yǎng)菌含量檢測 參照參考文獻［11］

方法，通過將所采集土壤樣品制成不同稀釋度的稀釋液，涂布TSA平板，37℃培養(yǎng)18～24 h后統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)稀釋度即可計算出土壤樣品中含菌數(shù)。

2．1．2 土壤中大腸菌群含量檢測 制備一系列稀釋度的土壤菌懸液，方法同上。參照參考文獻［17］通過無菌吸取1 mL土壤菌懸液先接種月桂基硫酸鈉胰蛋白胨肉湯(LST)，再取一菌環(huán)接種至黃綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)，最后將陽性管菌液接種伊紅美藍培養(yǎng)基進行細菌鑒定。將經(jīng)過LST－BGLB兩步發(fā)酵之后，并且分離培養(yǎng)有大腸桿菌的陽性管數(shù)記錄，對照MPN三次重復(fù)表查看結(jié)果。

2．1．3 土壤中大腸桿菌含量檢測 取不同稀釋度的土壤懸液100μL涂布麥康凱平板，37℃培養(yǎng)18～24 h后統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)稀釋度可大致估算土壤中大腸桿菌含量。

2．1．4 評價標(biāo)準(zhǔn) 判定土壤污染程度的評價標(biāo)準(zhǔn)有兩種，即根據(jù)土壤細菌總數(shù)或大腸菌值進行評價［12］。大腸菌值是指能檢出大腸桿菌的最小土壤量(單位:g)。比較清潔的土壤，每克細菌總數(shù)在一萬左右;嚴(yán)重污染的土壤，細菌總數(shù)可達數(shù)百萬。清潔土壤中大腸菌值＞1．0;輕度污染土壤大腸菌值1．0～0．01;中度污染土壤大腸菌值 0．01 ～0．001;嚴(yán)重污染土壤大腸菌值 ＜0．001。

2．2 雞場土壤大腸桿菌的分離鑒定

2．2．1 細菌分離培養(yǎng)及純化 無菌操作取100μL土壤菌懸液涂布麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h。挑取陽性菌落接種于伊紅美藍瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h。陽性菌落接種于普通瓊脂平板上分區(qū)劃線進行擴大純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18～24 h后，對菌落形態(tài)進行觀察，挑取單菌落進行革蘭氏染色鑒定。

2．2．2 生化試驗 按常規(guī)方法進行單糖發(fā)酵、吲哚、MR和VP試驗等生化試驗。

2．2．3 致病性試驗 參照參考文獻［13］方法將所分離菌株的24 h肉湯培養(yǎng)物用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌濃度為1．0×108CFU/mL，經(jīng)腹腔注射接種25～30 g小鼠，每只0．2 mL，接種3只。接種后開始記錄發(fā)病與死亡情況。對死亡小鼠進行剖檢，從心臟和肝臟進行細菌復(fù)分離與鑒定。

2．3 消毒劑對大腸桿菌的殺滅效果試驗

2．3．1 分離株菌懸液的制備 試驗使用菌種第3～16代的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物，吸取5．0 mL滅菌1×PBS加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹洗以便洗下菌苔。將細菌懸液轉(zhuǎn)移至另一無菌EP管中，漩渦混合30 s至1 min，即為所使用細菌懸液。

2．3．2 中和劑鑒定試驗 按消毒技術(shù)規(guī)范［14］規(guī)定的中和劑鑒定試驗程序設(shè)計4組試驗，以大腸桿菌漢川雞場分離株為試驗菌，分別對兩種消毒劑最高使用濃度進行中和劑鑒定，符合判斷標(biāo)準(zhǔn)者作為相應(yīng)中和劑。判斷標(biāo)準(zhǔn)為:第1、2和3組有相似量試驗菌生長，平皿培養(yǎng)生長菌量在30 CFU/mL～300 CFU/mL之間，且組間菌落數(shù)誤差率不超過15%;第4組無菌生長。符合上述標(biāo)準(zhǔn)即為所用中和劑及其濃度為合格。

2．3．3 定量懸浮消毒試驗 參照文獻方法［14］分組。(1)試驗組:臨用前取0．5 mL試驗菌懸液(5×106CFU/mL～5×107CFU/mL)于試管中，加入0．5 mL 30 g/L的 BSA。置于20℃ ±1℃水浴5 min后，加入4．0 mL待測濃度的戊二醛(二氧化氯)，混勻后作用至預(yù)定時間，取0．5 mL試驗菌與消毒劑混合液加至4．5 mL相應(yīng)中和劑中，混勻后水浴作用10 min。分別取0．1 mL涂布三個麥康凱瓊脂平板。37℃恒溫培養(yǎng)16～24 h后觀察并計數(shù)并計算殺滅對數(shù)值。(2)陽性對照組:與試驗組相似，以標(biāo)準(zhǔn)硬水代替戊二醛(二氧化氯)消毒劑進行試驗。(3)陰性對照組:取當(dāng)次試驗所用中和劑、1×PBS、標(biāo)準(zhǔn)硬水各1．0 mL于同一EP管內(nèi)，分別取0．1 mL涂布三個麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16～24 h后觀察。

2．3．4 以土壤為載體的消毒試驗 參照參考文獻［8］方法分組。(1)試驗組:取1 mL菌液(1×106CFU/mL－1×108CFU/mL)加入放有4 g土壤的滅菌平皿內(nèi)混勻。加入5 mL已知濃度的戊二醛(二氧化氯)作用至預(yù)定時間，取0．5 g試驗菌、消毒劑及土壤混合液加至4．5 mL相應(yīng)中和劑中，混勻后作用10 min。取0．1 mL涂布三個麥康凱瓊脂平板，于37℃恒溫培養(yǎng)16～24 h后觀察計數(shù)并計算殺滅對數(shù)值。(2)陽性對照組:以標(biāo)準(zhǔn)硬水代替消毒劑進行試驗。(3)陰性對照組:參見定量懸浮試驗 2．3．3。

2．3．5 數(shù)據(jù)處理 計算各組的活菌濃度N(CFU/mL)，并換算為對數(shù)值，按下式計算殺滅對數(shù)值:殺滅對數(shù)值(KL)=對照組平均活菌的對數(shù)值(lgN0)/試驗組活菌濃度對數(shù)值(lgNt)。

3 結(jié)果與分析

3．1 湖北省養(yǎng)雞場污染情況調(diào)查結(jié)果 通過對2009～2010年在湖北省漢川、江夏等地采集的養(yǎng)雞場土壤菌含量進行測定并對其污染情況進行評價。所測定雞場土壤都有不同程度的污染，且春秋兩季土壤污染較夏冬兩季嚴(yán)重(表1、表2)。

表1 土壤污染情況(大腸菌值)

表2 土壤污染情況(土壤總菌含量)

3．2 分離菌株的鑒定

3．2．1 培養(yǎng)特性及形態(tài)特征 分離菌株在各培養(yǎng)基上呈現(xiàn)典型大腸桿菌菌落特征:在營養(yǎng)瓊脂上形成圓形隆起、邊緣整齊、表面光滑濕潤、半透明且近似灰白色的菌落。在麥康凱瓊脂上形成圓形隆起、邊緣整齊、表面光滑濕潤且直徑約2．0 mm紅色菌落;在伊紅美藍瓊脂上形成圓形隆起、表面光滑、中央呈紫黑色且對光觀察具有金屬光澤、直徑約2～3 mm的菌落。分離菌為革蘭氏陰性、無芽胞短桿菌，多單個散在或成對分布，符合大腸桿菌的形態(tài)特征。

3．2．2 生化鑒定結(jié)果 結(jié)果顯示該分離菌能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和山梨醇，不發(fā)酵蔗糖，不液化明膠，吲哚試驗和MR試驗均為陽性;VP試驗陰性，初步判定為大腸桿菌。

3．2．3 致病性試驗結(jié)果 接種分離菌株的三只小鼠在接種后48～72 h全部死亡，剖解未見明顯病理變化。從死亡小鼠的心臟和肝臟均可分離到接種菌。復(fù)分離培養(yǎng)與生化鑒定結(jié)果均與接種菌一致。

3．3 消毒劑對大腸桿菌分離株殺滅效力測定

3．3．1 中和劑試驗結(jié)果 結(jié)果表明采用中和劑10 g/L 吐溫－80配合10 g/L甘氨酸與5 g/L卵磷脂的PBS溶液，能夠中和0．02%戊二醛對大腸桿菌的殺滅作用;采用中和劑5 g/L硫代硫酸鈉與8 g/L吐溫－80的PBS溶液，能夠中和400 mg/L二氧化氯對大腸桿菌的殺滅作用，且中和劑與中和產(chǎn)物對指示菌生長均無明顯影響，符合中和劑鑒定試驗要求各項指標(biāo)。戊二醛和二氧化氯中和劑鑒定結(jié)果見表3和表4。

表3 戊二醛殺滅大腸桿菌中和劑鑒定結(jié)果

表4 二氧化氯殺滅大腸桿菌中和劑鑒定結(jié)果

3．3．2 定量懸浮消毒試驗結(jié)果 戊二醛和二氧化氯定量懸浮消毒試驗結(jié)果分別見表5和表6。從表5可以看出，0．02%戊二醛作用5 min或0．01%戊二醛作用30 min對大腸桿菌的殺滅率均可達到100%，而0．05%戊二醛作用60 min才能完全殺滅大腸桿菌。從表6可以看出，50 mg/L與100 mg/L二氧化氯作用2min對大腸桿菌的殺滅率均可達到100%，而25 mg/L二氧化氯作用10 min才能完全殺滅大腸桿菌。

表5 戊二醛對大腸桿菌的殺滅效果(存活對數(shù)值)

表6 二氧化氯對大腸桿菌的殺滅效果(存活對數(shù)值)

3．3．3 以土壤為載體的消毒試驗結(jié)果 戊二醛和二氧化氯土壤載體消毒試驗結(jié)果分別見表7和表8。從表7可以看出，0．02%戊二醛作用10 min或0．01%戊二醛作用30 min對大腸桿菌的殺滅率均可達到100%，而0．0025%戊二醛作用60 min也未能完全殺滅大腸桿菌。從表8可以看出，400 mg/L二氧化氯作用10 min或300 mg/L二氧化氯作用30 min對大腸桿菌的殺滅率均可達到100%;而200 mg/L二氧化氯即使作用60 min也未能完全殺滅大腸桿菌。

表7 戊二醛對大腸桿菌的殺滅效果(存活對數(shù)值)

表8 二氧化氯對大腸桿菌的殺滅效果(存活對數(shù)值)

4 討論

無論以總菌含量還是以大腸菌值為標(biāo)準(zhǔn)，土壤污染程度均表現(xiàn)出春秋兩季高于夏冬兩季。春秋兩季土壤污染嚴(yán)重可能和季節(jié)氣候相關(guān)，一般春秋兩季適宜的氣候條件適宜大多數(shù)細菌的生長，而夏季高溫、冬季寒冷一般不利于細菌的生長繁殖，這可能是造成土壤中細菌乃至病原菌數(shù)量較多的原因之一。同時，養(yǎng)殖場畜禽在春秋兩季發(fā)病情況也會有所增加，可能通過氣溶膠等進行病原菌的傳播，從而造成土壤中病原菌含量的相對增加。因此，在適宜病原菌生長的春秋季節(jié)尤其要加強雞舍乃至附近土壤的消毒工作，防止病原菌進一步擴散。

化學(xué)消毒劑因其廣譜消毒性在畜牧生產(chǎn)中對于控制病原微生物的傳播、預(yù)防和治理流行疾病具有非常積極的意義［15］。王靜等通過對規(guī)?；u場消毒前后結(jié)果表明，消毒后雞舍內(nèi)空氣中細菌含量明顯降低，減少了疫病發(fā)生的可能［16］。但目前有關(guān)對土壤病原菌進行消毒殺滅的研究還很少［10］。王莉等研究了四種消毒劑對土壤中污染的霍亂弧菌的殺滅效果，500 mg/L(有效氯)作用3 min即可殺滅田土中的霍亂弧菌［8］。廖駿等研究也表明，幾種含氯消毒劑對土壤中埃爾托弧菌具有良好的殺滅效果。這些都與本研究中二氧化氯具有較強的殺滅效果相一致［18］。研究應(yīng)用戊二醛和二氧化氯的定量懸浮試驗和以土壤為載體的消毒試驗都表明這兩種消毒劑均具有良好的消毒效果，但土壤的存在明顯降低了消毒劑的殺菌效力。此次試驗由于土壤載體的量小，故其消毒效果尚需進一步通過田間試驗來加以驗證，但仍具有一定的指導(dǎo)意義，建議針對雞場污染土壤中的大腸桿菌可選擇0．02%戊二醛或400 mg/L二氧化氯進行消毒處理。在養(yǎng)殖場實際應(yīng)用過程中，還應(yīng)根據(jù)具體情況適當(dāng)調(diào)整所用消毒劑的種類和濃度以達到最佳殺菌效果，從而保證土壤的安全潔凈，有效控制疾病的流行、蔓延，保障人類的健康。

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