米糠中阿魏酸提取工藝的優(yōu)化①

姜 帥，劉翠娟，慎愛民，張 磊，佟德成，宋琳琳，趙 巖，楊治偉，呂玉光

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院生物藥制劑黑龍江省重點實驗室，黑龍江 佳木斯 154007)

0 引言

米糠是指稻谷脫殼后依附在糙米上的表面層，其由外果皮、中果皮、交聯(lián)層、種皮和糊層組成，化學(xué)成分為糖類、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素和灰分.黑龍江是中國的米都，富產(chǎn)水稻，其占全國產(chǎn)量的三分之一.近年來，科學(xué)工作者在米糠深加工、副產(chǎn)品綜合利用上取得了豐碩成果和收益.在米糠中的阿魏酸含量較高，對米糠中阿魏酸的提取分離研究具有較好的前景[1].

阿魏酸(Ferulic acid)的化學(xué)名稱為4－輕基－3－甲氧基肉桂酸，其廣泛存在于植物細(xì)胞壁中，多以酯的形式存在，與碳水化合物以共價鍵連接，游離態(tài)的阿魏酸含量很低[2].阿魏酸有順式和反式兩種，順式為黃色油狀體，反式為白色至微黃色結(jié)晶體.反式阿魏酸常作為一些藥的活性化合物，被廣泛應(yīng)用于食品和藥品行業(yè)中[3].研究表明阿魏酸是阿魏、川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊等多種中藥的有效成分之一.隨著對阿魏酸廣泛深入地研究，發(fā)現(xiàn)阿魏酸及其衍生物具有多方面的生物活性，如抗血小板聚集、促進(jìn)血小板解聚、降血脂、抗血栓、抗氧化、抗自由基、抗炎、抗腫瘤抗突變、增強(qiáng)免疫功能以及增強(qiáng)人體精子活力和運動性等，且毒性很低，激起有關(guān)學(xué)者的興趣[4].

近些年，超聲強(qiáng)化提取法已被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，特別是醫(yī)藥行業(yè)的中藥提取中[5].本試驗將這一技術(shù)應(yīng)用于阿魏酸的提取，優(yōu)化提取條件以期獲得較高產(chǎn)率和純度的阿魏酸，為今后產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù).

1 儀器與試劑

1.1 儀 器

VERTEX70傅里葉紅外光譜儀(德國布魯克公司);SHB－III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DT－LNS集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省予華儀器有限公司);KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BS110型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司);PHS－3C精密pH計(上海雷磁創(chuàng)益儀器代表有限公司);UV757CRT紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);101－1電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實驗儀器有限公司);DZG－6050真空干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司);UV757CRT紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司).

1.2 實驗試劑

新鮮米糠(慶安鑫利達(dá)米業(yè)公司)，阿魏酸(標(biāo)準(zhǔn)品貴州迪大科技有限責(zé)任公司)正己烷(分析純天津市凱通化學(xué)制劑有限公司)，乙醚(分析純天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)，石油醚(90－120℃)(分析純哈爾濱市新達(dá)化工廠)，無水乙醇(分析純天津市凱通化學(xué)制劑有限公司)，乙酸乙酯(分析純哈爾濱市新達(dá)化工廠)，氫氧化鈉(分析純天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)，無水碳酸鈉(分析純齊齊哈爾輕工學(xué)院試劑廠)，亞硫酸鈉(分析純天津市凱通化學(xué)制劑有限公司)，蒸餾水(分析純佳木斯市化學(xué)試劑廠)，鹽酸(分析純佳木斯市化學(xué)試劑廠).

2 實驗方法

(1)將500g新鮮米糠置于烘箱中，在105℃下活化20min，冷卻后用正己烷(l:3，w/v)浸泡5h脫脂2次，再于真空干燥箱中干燥5h.

(2)提取法①:參照文獻(xiàn)[6]，分別量取3份各40g預(yù)處理后的米糠放入置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中的1000ml圓底燒瓶中，以1:8(w/v)的比例分別各加入1%氫氧化鈉－乙醇(4:1，v/v)、0.2g/L的亞硫酸鈉，各在80℃下加熱回流6h，擠壓過濾，濃鹽酸調(diào)pH值為1左右，抽濾，減壓蒸餾出乙醇，各取10mL上清液，3000r/min離心分離3min，上清液置于分液漏斗中，分別用乙酸乙酯萃取三次，每次10mL，合并萃取液，2%碳酸鈉萃取三次，每次10mL，分別合并堿液，乙醚洗滌堿液至澄清，棄去乙醚，堿液加濃鹽酸調(diào)pH=1左右.減壓蒸餾出乙酸乙酯，殘渣溶于10mL乙醇，精密量取0.1mL，乙醇定容至 10mL.所得三個樣品分別標(biāo)注為A1，A2，A3.剩余液回流蒸出乙醇精制提純.

(3)提取法②:另外分別量取3份40g預(yù)處理后的米糠放入置于超聲波清洗器中的1000ml圓底燒瓶中，以1:8(w/v)的比例分別各加入1%氫氧化鈉 － 乙醇(4:1，v/v)、0.2g/L的亞硫酸鈉，各在80℃下加熱回流4h，擠壓過濾，濃鹽酸調(diào)pH值為1左右，抽濾，減壓蒸餾出乙醇，各取10mL上清液，3000r/min離心分離3min，上清液置于分液漏斗中，分別用乙酸乙酯萃取三次，每次10mL，合并萃取液，2%碳酸鈉萃取三次，每次10mL，分別合并堿液，乙醚洗滌堿液至澄清，棄去乙醚，堿液加濃鹽酸調(diào)pH=1左右.減壓蒸餾出乙酸乙酯.殘渣溶于10mL乙醇，精密量取0.1mL，乙醇定容至10mL.所得三個樣品分別標(biāo)注為 B1，B2，B3.剩余液回流蒸出乙醇精制提純.

(4)采用VERTEX 70型傅里葉紅外光譜儀對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征，KCr壓片，掃描范圍4000 cm－1～400 cm－1.

(5)核磁共振波譜的測定和解析

將樣品阿魏酸溶解于DMSO－d6中，以TMS為內(nèi)標(biāo)測試其1H－NMR和13C－NMR譜圖，并進(jìn)行解析.結(jié)構(gòu)式為:

圖1

圖2 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品與提取法①的紅外光譜

圖3 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品與提取法②的紅外光譜

儀器 Bruker AVANCE－400MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀;樣品 超聲強(qiáng)化提取精制真空烘干后的阿魏酸;溶劑 氘代二甲基亞砜DMSO－d6(含0.1%內(nèi)標(biāo)物TMS);試樣的制備:將超聲強(qiáng)化提取精制真空烘干后的樣品阿魏酸約5mg溶解在0.5ml DMSO－d6溶劑中制成溶液，裝于5mm樣品管中待測定.

(6)采用紫外分光光度法進(jìn)行阿魏酸含量的測定.

3 結(jié)果分析

3.1 樣品的紅外表征分析

提取法①樣品的紅外光譜與阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜基本一致.由圖1可見:3444cm－1，示有羥基;2920cm－1，示有甲氧基;1718cm－1，示有羧基存在;1463cm－1，834cm－1，為芳環(huán)特征吸收;1211cm－1，示有酚的結(jié)構(gòu)存在.

圖4 阿魏酸的1H－NMR譜

圖5 阿魏酸的13C－NMR譜

提取法②樣品的紅外光譜與阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜基本一致.由圖2可見:3399cm－1，示有羥基結(jié)構(gòu);2920cm－1，示有甲氧基結(jié)構(gòu);1718cm－1，示有羧基存在;1515cm－1，1429cm－1，為芳環(huán)特征吸收;1211cm－1，示有酚的結(jié)構(gòu)存在.

3.2 核磁共振譜圖解析

3.2.1 阿魏酸1H－NMR的解析

阿魏酸的1H－NMR譜見圖3，其相關(guān)數(shù)據(jù)及歸屬列于表1.

表1 阿魏酸的1H－NMR數(shù)據(jù)

表2 阿魏酸的13C－NMR數(shù)據(jù)

圖6 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

阿魏酸分子中存在三個獨立的自旋系統(tǒng)，各部分之間可以認(rèn)為不存在偶合作用.甲氧基呈現(xiàn)單峰，不和任何氫發(fā)生偶合關(guān)系.各氫的化學(xué)位移見表1，2－H和3－H的化學(xué)位移值相差較大，是因為這兩個烯氫處于苯環(huán)和羰基的大共軛系統(tǒng)中，2－H處于負(fù)電區(qū)，而3－H處于正電區(qū)，同時3－H也處于苯環(huán)的去屏蔽區(qū).－COOH和－OH兩個活潑氫的化學(xué)位移分別為12.13和9.56ppm，這和測定條件例如溫度、濃度以及所用溶劑等有關(guān).

3.2.2 阿魏酸的13C－NMR的解析:

阿魏酸的13C－NMR譜見圖4，其相關(guān)數(shù)據(jù)及歸屬列于表2.

阿魏酸的碳信號可以為三組:第一組δ 168.1為α，β－不飽和酸的基碳信號.在常見官能團(tuán)中，羰基的碳原子由于共振位置在最低場，因為很易被識別.羰基的碳原子共振之所以在最低場，從共振式可以看出羰基的碳原子缺少電子，故共振在最低場.如羰基與雜原子或不飽和基團(tuán)相連，羰基的碳原子的電子短缺得以緩解，因此共振移向高場方向.由于上述原因酮、醛共振位置在最低場，一般δ＞195ppm，酰氯、酰胺、酯、酸酐等相對酮、醛共振位置明顯地移向高場方向，一般δ＜185ppm.α，β－不飽和酮、醛的δ也減少，但不飽和鍵的高場位移作用較雜原子弱.第二組 δ 111.3～ δ 149.2為烯碳和苯環(huán)上的碳信號.取代烯烴的碳信號一般為100～150ppm.苯環(huán)的δ值的因素很多，如取代基電負(fù)性、重原子效應(yīng)、中介效應(yīng)和電場效應(yīng)等.第三組δ 55.8為連氧碳信號.連氧碳信號的化學(xué)位移值一般在50～90ppm.

3.3 阿魏酸含量的測定

采用紫外分光光度法測定測定兩類樣品中阿魏酸的百分含量，來說明工藝優(yōu)化的效果.

(1)配制五個不同濃度的100mL的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，溶劑為乙醇.根據(jù)中國藥典2005年版第一部可查阿魏酸最大吸收波長為323nm處，分別測得其吸光度A值見表3.作出阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5.根據(jù)線性回歸方程為A=0.17925 C －0.0192得出阿魏酸的吸光系數(shù)為E=0.17925(r=0.9982).(2)取上述實驗方法①提取的阿魏酸樣品A1，A2，A3分別各精取1mL乙醇定容為100mL的待測液.測得其紫外吸光度值分別為 0.393，0.385，0.397.其吸光度平均值A(chǔ)=0.391.根據(jù)朗伯比爾定律A=ECL可以求得待測液的濃度，進(jìn)而求得①提取法所得阿魏酸的含量為87.1%.同理，取上述實驗方法②提取的阿魏酸樣品 B1，B2，B3分別各精取1mL乙醇定容為100mL的待測液.測得其紫外吸光度值分別為 0.419，0.416，0.420.其吸光度平均值A(chǔ)=0.418.進(jìn)而求得②提取法所得阿魏酸的含量為92.3%.

表3 不同濃度的阿魏酸在乙醇溶劑中的吸光度值

采用超聲強(qiáng)化提取法提取米糠中阿魏酸，收率提高5.2%.

4 結(jié)論

采用超聲強(qiáng)化提取的方法，對米糠中提取反式阿魏酸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化處理，所得樣品的收率提高5.2%.

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