蒲公英抗氧化活性部位研究1）

戎晉華，趙文英＊，黃巧燕，李學(xué)強(qiáng)

（1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島266042；2.青島市海泊河污水處理廠(chǎng)）

蒲公英為菊科蒲公英屬植物，是臨床上常用的中藥材，具有很多的藥理作用，主要包括抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂等作用，是有非常好的開(kāi)發(fā)前景的可以藥食同用的中草藥。蒲公英含有多種有效成分，如黃酮類(lèi)、倍半萜內(nèi)酯類(lèi)、酚酸類(lèi)、蒲公英甾醇、揮發(fā)油類(lèi)等［1］，這些成分大多具有較強(qiáng)的抗氧化活性。目前人們對(duì)其各類(lèi)成分的提取研究報(bào)道較多，因其有“天然抗生素”之美稱(chēng)，對(duì)其活性研究主要集中在抑菌活性方面，而對(duì)其他作用報(bào)道較少，尤其是抗氧化活性的研究目前尚少見(jiàn)報(bào)道。大量研究證實(shí)，中草藥能延緩衰老與治療疾病大多與其抗氧化作用密切相關(guān)。本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)水提法來(lái)提取蒲公英，然后將提取液用不同極性的有機(jī)溶劑分層萃取，并研究各層提取物的抗氧化活性，為進(jìn)一步研究蒲公英中抗氧化活性成分提供依據(jù)，為蒲公英的開(kāi)發(fā)應(yīng)用積累有價(jià)值的資料。

FRAP法［2］、超氧陰離子清除率法和DPPH法這三種方法廣泛應(yīng)用于各種天然提取物抗氧化活性的測(cè)定，是較簡(jiǎn)便快捷的測(cè)抗氧化能力的方法。FRAP法測(cè)定總抗氧化能力，測(cè)量的是酸性條件下抗氧化物將Fe3＋還原成Fe2＋的能力。超氧陰離子清除率法是根據(jù)抗氧化劑對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力對(duì)其抗氧化性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。DPPH法是根據(jù)抗氧化劑清除DPPH·自由基的能力測(cè)得抗氧化劑的活性。DPPH·不能與只含有一個(gè)－OH的芳香酸反應(yīng)，也不能與B－環(huán)上沒(méi)有－OH的類(lèi)黃酮反應(yīng)。利用這三種方法全面衡量蒲公英的抗氧化活性，為蒲公英的抗氧化活性研究及天然藥物的開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

M297714型電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；DZKW－4型電子恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；KH－250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀有限公司；RE－52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；SHB－Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；GZX－9070MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；LG－04A型四兩裝高速中藥粉碎機(jī)，瑞安市百信藥機(jī)器械廠(chǎng)；UV762型紫外／可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

蒲公英，購(gòu)于本地德全堂大藥店；三氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)品，山東威世達(dá)實(shí)業(yè)有限公司；DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)sigma公司；TPTZ標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)sigma公司；FRAP工作液（由25mL 300mmol／L pH3.6的醋酸鹽緩沖液、2.5mL 10mmol／L TPTZ 溶 液、2.5mL 20mmol／L FeCl3溶液混合而成）。其它試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 傳統(tǒng)水提法

稱(chēng)取50g蒲公英藥材，加入約500mL蒸餾水（料液比為1∶10），加熱至煮沸提取30min，提取3次，合并三次提取液，濃縮至約800mL。用75%乙醇多次醇沉多糖，取上清液。

將提取液用多層紗布過(guò)濾3次，收集澄清的黃色濾液約300mL，置于500mL的分液漏斗中，加入100mL石油醚進(jìn)行溶劑萃取，收集上層溶液，同法萃取三次，合并上層石油醚萃取液。再用相同方法依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取液，正丁醇萃取液，收集下層水層。

分別將各層提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，收集各層提取物，水浴鍋上干燥，稱(chēng)量，保存。

1.2.2 蒲公英的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 FRAP法總抗氧化力測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：分別吸取不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液0.1mL，加入3.0mL FRAP工作液，再加入0.3mL去離子水，混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)5min，于593 nm處測(cè)定其吸光度，用去離子水調(diào)零，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程：y＝0.1761x－0.0757，R2＝0.9995，在0.15～0.90mmol／L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。樣品的抗氧化能力以FRAP值表示［3］：1FRAP單位＝1mmol／L FeSO4，即樣品的抗氧化能力相當(dāng)于FeSO4的mmol／L數(shù)。

稱(chēng)取各層提取物適量，配制成一定濃度的溶液，分別量取0.1mL溶液，加入3.0mL FRAP工作液，再加入0.3mL去離子水，混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，于593nm處測(cè)定其吸光度，用去離子水調(diào)零。

1.2.2.2 超氧陰離子清除作用［4］

稱(chēng)取各層提取物適量，配制成一定濃度的溶液，取0.05mol／L，pH為8.2的Tris·HCl緩沖液4.5 mL于試管中，置于25℃水浴中預(yù)熱20min，加入不同溶劑提取的蒲公英提取液0.1mL，2.5mol／L鄰苯三酚0.4mL，混勻后在25℃水浴中反應(yīng)4min，立即用10mol／L HCl兩滴終止反應(yīng)，并在299nm處測(cè)定吸光度（用蒸餾水調(diào)零），空白組的0.1mL去離子水代替樣品，并按下式計(jì)算清除率：

清除率＝（1－A試樣／A空白）×100%；

1.2.2.3 DPPH·自由基清除能力［5］

配制5×10－5mol／L的DPPH·溶液。分別取各層提取物0.01g與50mL甲醇配成0.2g／mL的溶液。取各溶液1.5mL與甲醇2.5mL配成溶液，再取各溶液1.5mL與DPPH溶液2.5mL配成溶液，最后取DPPH溶液2.5mL與甲醇1.5mL配成溶液，充分震蕩后黑暗下室溫放置，30min后測(cè)定混合溶液在517nm處的吸光度。利用DPPH溶液的特征紫紅色基團(tuán)的吸收，用紫外－可見(jiàn)分光光度法測(cè)定反應(yīng)后的提取物溶液在517nm吸收的下降程度表示其對(duì)有機(jī)自由基的清除能力。

試樣提取液對(duì)DPPH·自由基的清除率可用下式計(jì)算：

P＝［1－（Ai－Aj）／Ac］×100%

其中，Ai＝2.5mL DPPH溶液＋1.5mL待測(cè)溶液吸光度；Aj＝1.5mL待測(cè)溶液＋2.5mL溶劑的吸光度；Ac＝2.5 mL DPPH＋1.5mL溶劑的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒲公英的提取

由上表得，各層提取物的質(zhì)量分布趨勢(shì)：水層＞正丁醇層＞乙酸乙酯層＞石油醚層。提取液中水層質(zhì)量最多，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他三層，而其他三層質(zhì)量相差較少。水層為極性成分，正丁醇層和乙酸乙酯層為中極性成分，石油醚層為非極性成分，說(shuō)明蒲公英中成分質(zhì)量分布為強(qiáng)極性成分＞中極性成分＞非極性成分，極性成分相對(duì)較多。

2.2 蒲公英的抗氧化活性

圖2 各層提取物對(duì)超氧陰離子清除率

圖3 各層提取物對(duì)DPPH·自由基的清除率

由以上數(shù)據(jù)得，3種方法所得結(jié)果基本一致，各層提取物均具有超氧陰離子和DPPH·自由基清除作用，均具有抗氧化活性，蒲公英中含有很多抗氧化成分，黃酮類(lèi)物質(zhì)是主要的天然抗氧化劑［6］，它具有活潑的酚羥基，在遇到活性氧自由基時(shí)，易失去酚羥基上的氫，具有直接清除或淬滅·、·OH、H2O2等活性氧、自由基的作用［7］。蒲公英提取物包括黃酮和其它含酚羥基的化合物，在這個(gè)過(guò)程中可能起著互補(bǔ)或者協(xié)同的作用。

三種方法各層提取物的抗氧化能力均為：正丁醇層＞乙酸乙酯層＞水層＞石油醚層。石油醚萃取的是非極性成分，如脂質(zhì)、揮發(fā)油、游離甾體及三萜類(lèi)化合物等，乙酸乙酯主要萃取出游離生物堿、有機(jī)酸、黃酮、香豆素苷元等中等極性的物質(zhì)，在乙酸乙酯后用正丁醇萃取，正丁醇相中一般來(lái)說(shuō)是中等極性中極性相對(duì)較大的成分，含苷類(lèi)成分比較多。也就是說(shuō)，乙酸乙酯層中可能主要含有黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)和酚酸類(lèi)等抗氧化活性較強(qiáng)的成分，正丁醇中可能含有黃酮苷等抗氧化活性較強(qiáng)的成分，水層含有的蛋白質(zhì)和多糖也有一定的抗氧化活性，石油醚中含有的倍半萜內(nèi)酯類(lèi)及植物甾醇等也有抗氧化活性。

但3種方法所得結(jié)果也有所差異，F(xiàn)RAP法中水層和石油醚層抗氧化活性相當(dāng)，超氧陰離子清除率法中水層和乙酸乙酯層抗氧化活性接近，DPPH法中正丁醇層和乙酸乙酯層抗氧化活性基本相同，其他則相差較多；而超氧陰離子清除率法和DPPH法都用清除率表示，但二者所得的清除率相差很多，這說(shuō)明這3種方法是從不同層面對(duì)抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，能全面反應(yīng)蒲公英的抗氧化活性。

提取物雖然水層質(zhì)量較多，但抗氧化活性較弱，因此水層通常視為雜質(zhì)，不予研究。而活性最強(qiáng)的是正丁醇層和乙酸乙酯層，說(shuō)明蒲公英中具有抗氧化活性的成分大多數(shù)是中極性的，且是極性中極性偏大的，少數(shù)是極性的和非極性的。這可能是由于蒲公英中主要的抗氧化活性成分［8］既有以苷元形式存在，又有以苷的形式存在的，分別被乙酸乙酯和正丁醇萃取。具體這兩層中含有哪些成分，還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

文中采用FRAP法抗氧化活性實(shí)驗(yàn)、超氧陰離子清除率抗氧化活性實(shí)驗(yàn)和DPPH·自由基清除能力抗氧化活性實(shí)驗(yàn)這3種方法來(lái)檢測(cè)蒲公英各層提取物的抗氧化活性，結(jié)果可以看出，3種方法得各層提取物的抗氧化活性都是正丁醇層＞乙酸乙酯層＞水層＞石油醚層。

實(shí)驗(yàn)將蒲公英提取液用極性不同的3種有機(jī)溶劑分別萃取，即將提取液中各成分按極性不同分開(kāi)，然后研究各部分的抗氧化活性，從而找到抗氧化活性最強(qiáng)的成分，為蒲公英有效成分的純化分離提供依據(jù)，有助于進(jìn)一步研究蒲公英的成分，可以更好地促進(jìn)蒲公英的抗氧化活性在醫(yī)藥及保健等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)、應(yīng)用。蒲公英作為一種資源廣、提取方便、抗氧化作用顯著的藥用資源，用來(lái)研究開(kāi)發(fā)具有抗氧化功能的化妝品、保健品和藥物具有廣闊的應(yīng)用前景。

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