女貞子對(duì)實(shí)驗(yàn)性非酒精性脂肪肝大鼠防治作用△

楊念云，汪六英，秦歡，康佳寧，許紅梅，唐于平，劉培，錢大瑋

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046；2.揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)南京海陵藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210049)

中藥科技

女貞子對(duì)實(shí)驗(yàn)性非酒精性脂肪肝大鼠防治作用△

楊念云1*，汪六英2，秦歡1，康佳寧1，許紅梅1，唐于平1，劉培1，錢大瑋1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046；2.揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)南京海陵藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210049)

目的：復(fù)制大鼠非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，觀察女貞子對(duì)此模型的影響。方法：高脂飲食同時(shí)皮下注射小劑量四氯化碳復(fù)制大鼠非酒精性脂肪肝模型，在給予高脂飲食同時(shí)以女貞子對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，與正常飲食組對(duì)照。喂養(yǎng)4周后檢測(cè)血清肝臟酶學(xué)(ALT、AST)、血脂肝脂(TG、TC、LDLC、HDLC)水平；肝組織切片染色，顯微鏡觀察肝組織病理變化；并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：與正常組相比，模型組血清的肝功能和脂質(zhì)水平上升，肝細(xì)胞形態(tài)明顯改變，肝索消失或不清晰；與模型組相比，女貞子干預(yù)組血清肝功能指標(biāo)和脂質(zhì)水平均顯著下降，肝細(xì)胞氣球樣變較少，無明顯肝細(xì)胞壞死。結(jié)論：女貞子對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪肝有一定防治效果，能減輕脂肪沉積、改善血脂紊亂、糾正肝功能，保肝作用明顯。

女貞子；非酒精性脂肪肝；防治

近年來，由于生活水平提高、飲食結(jié)構(gòu)變化、運(yùn)動(dòng)量減少，我國脂肪肝的發(fā)病率逐年上升，非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)所占比例大大增加，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。NASH嚴(yán)重地影響著我國人民尤其是城市居民的生命健康，防治本病已成為全球普遍關(guān)注的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問題[1-4]。女貞子(Ligustri Lucidi Fructus)為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實(shí)，為常用藥食同源的藥材，其性味甘、苦、涼，入肝、腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎，明目烏發(fā)的功效，用于肝腎陰虛，眩暈耳鳴，腰膝酸軟，須發(fā)早白，目暗不明，內(nèi)熱消渴，骨蒸潮熱?，F(xiàn)代研究表明，女貞子主要含有三萜類、裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類和對(duì)羥基苯乙醇苷類等化學(xué)成分，具有保肝、提高機(jī)體免疫功能、抗衰老、對(duì)缺氧/缺糖損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)等多種藥理作用[5-14]。關(guān)于女貞子對(duì)NASH預(yù)防和治療的研究尚未見報(bào)道，我們前期較系統(tǒng)研究女貞子的活性成分，從中分離得到一系列三萜類、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類等成分[15-17]。本實(shí)驗(yàn)用女貞子干預(yù)高脂飲食和小劑量四氯化碳誘導(dǎo)建立的NASH模型小鼠，了解小鼠血脂、肝脂、肝功能以及肝病理改變，研究女貞子對(duì)小鼠NASH的預(yù)防和治療作用，為將其開發(fā)為產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠60只，體重(200±10) g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：scxk(浙)2007-0001。

1.1.2 高脂飲食飼料的配制 高脂飼料由豬油(15%)、蛋黃粉(10%)、膽固醇(4%)、膽酸鈉(1%)、普通飼料(70%)組成，將以上各成分人工充分混勻攪拌，壓成圓條狀，經(jīng)紫外光輻照消毒，烘干，包裝備用。

1.1.3 試劑 膽固醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；膽酸鈉(杭州微生物試劑有限公司)；四氯化碳(CCl4)(南京化學(xué)試劑廠)；金龍魚玉米油、豬油(市售)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、總膽固醇(CHO)試劑盒、低密度脂蛋白(LDLC)試劑盒、高密度脂蛋白(HDLC)試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)；護(hù)肝片(哈藥集團(tuán)，批號(hào)：20120509)。

1.2 方法

1.2.1 女貞子的提取 女貞子(1 kg)于2010年冬季采自南京，經(jīng)作者鑒定為女貞子干燥成熟果實(shí)。用70%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，靜置過濾，濾液減壓回收濃縮，真空干燥得棕色粉末狀物185 g，即女貞子提取物。課題組曾采用高效液相色譜法、可見分光光度法對(duì)女貞果實(shí)不同成熟期三萜類與裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類等成分進(jìn)行測(cè)定，主成分分析結(jié)果表明齊墩果酸、熊果酸、女貞苷可能同為影響女貞子藥材質(zhì)量的重要因子[18]。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立與分組 60只大鼠正常喂養(yǎng)一周后，大鼠體重達(dá)到(208.14±20.40) g，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組(n=10)，給予正常飼料；模型組(n=10)，給予高脂飼料；陽性藥干預(yù)組(n=10)，給予護(hù)肝片(每日以150 mg·kg-1護(hù)肝片灌胃給藥)與高脂飼料；女貞子高中低干預(yù)組(n=10×3)，分別給予女貞子(每日以600,300,150 mg·kg-1女貞子提取物灌胃給藥)與高脂飼料。各組大鼠每日按體重給予50 g·kg-1的食物，喂養(yǎng)期間每日稱體重。給藥同時(shí)，除正常對(duì)照組以外各組于第1天、第7天、第14天、第21天、第28天皮下注射40%CCl4(用玉米油配制)，劑量為4 mL·kg-1。4周后大鼠眼球取血(前一天晚上禁食)，檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)。

1.2.3 血清肝臟酶學(xué)、血脂、肝脂水平及肝指數(shù)檢測(cè) 大鼠稱重后，眼眶取血，離心后取上清液；頸椎脫臼法處死，分離肝臟，稱重，計(jì)算肝指數(shù)；取部分肝組織勻漿，離心后取上清。用試劑盒測(cè)定血清和肝臟AST、ALT、TG、TC、LDLC和HDLC。

1.2.4 肝組織病理學(xué)變化觀察 大鼠眼球取血后，頸椎脫臼法處死，分離肝臟，部分肝組織用4%甲醛固定36 h后，HE染色，觀察肝組織形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 女貞子對(duì)血脂水平和肝功能水平的影響

由表1可知，與模型組相比較，護(hù)肝片組、女貞子各組均能顯著降低血清TG、TC、LDLC水平(P<0.05或P<0.01)，顯著升高HDLC(P<0.05或P<0.01)；護(hù)肝片組、女貞子各組均能顯著降低AST、ALT水平(P<0.05或P<0.01)。

2.2 女貞子對(duì)肝指數(shù)和肝脂質(zhì)的影響

由表2可知，與模型組相比較，護(hù)肝片組、女貞子組均能顯著降低肝指數(shù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；護(hù)肝片組、女貞子各組均能降低肝臟TC、TG水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 女貞子對(duì)NASH大鼠血脂水平和肝功能水平的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；N(正常組)、M(模型組)、HGP(護(hù)肝片組)、NZZL(女貞子低劑量組)、NZZM(女貞子中劑量組)、NZZG(女貞子高劑量組)

表2 女貞子對(duì)NASH大鼠體重、肝指數(shù)、肝脂質(zhì)的影響

2.3 女貞子對(duì)大鼠肝組織病理變化的影響

光鏡下觀察顯示，正常組大鼠的肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核位于中央，胞核清晰，胞質(zhì)均勻，肝索呈放射狀排列，肝竇正常，肝組織無變性。模型組肝細(xì)胞腫脹、體積較正常細(xì)胞明顯增大，細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的脂滴空泡，嚴(yán)重者胞質(zhì)疏松呈漁網(wǎng)狀，細(xì)胞核被擠壓于細(xì)胞一邊，部分消失，胞漿染色不均勻，肝組織具有明顯脂肪變性。女貞子組和護(hù)肝片組較模型組脂肪變性和水樣變性程度明顯減輕，炎癥反應(yīng)減輕，肝索輕微變形，部分肝細(xì)胞呈水樣變性。結(jié)果見圖1。

圖1 女貞子對(duì)NASH大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響

3 討論

NASH是一類肝組織學(xué)改變與酒精性肝病相類似，但無過量飲酒史的臨床病理綜合征。病理學(xué)改變包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化和脂肪性肝硬化4個(gè)病理過程，其中NASH是單純性脂肪肝發(fā)展為肝纖維化的必經(jīng)的病理階段。在NASH早期階段，去除病因和控制原發(fā)病后，肝臟病變可得到逆轉(zhuǎn)。但任其發(fā)展，則可演變?yōu)楦斡不?，即使積極治療也難使肝臟病理學(xué)改變恢復(fù)正常。所以早期干預(yù)對(duì)非酒精性脂肪性肝病的逆轉(zhuǎn)有著重要意義。

女貞子具有滋補(bǔ)肝腎之功效，用于治療肝腎陰虛等癥。作為保肝藥物廣泛用于臨床。在實(shí)驗(yàn)研究方面，有報(bào)道[19-20]女貞子及其有效成分灌胃治療CCl4所致慢性肝損傷大鼠，結(jié)果表明女貞子能夠顯著降低CCl4所致肝損傷大鼠血清的ALT、AST、GGT、ALP等酶水平，顯著改善其一般生活及活動(dòng)狀況，具有一定的護(hù)肝降酶作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，小劑量CCl4皮下注射結(jié)合高脂飲食4周后，模型組大鼠肝臟組織學(xué)可見彌漫性肝細(xì)胞大泡樣脂肪病變，壞死及纖維化，體重顯著增長，增長速率較其余組快，肝指數(shù)較正常組高，血脂代謝發(fā)生紊亂，TG、TC、LDLC明顯增高，HDLC明顯降低，ALT、AST增高[21-22]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高脂飲食和CCl4所致NASH模型，同時(shí)給予女貞子飲食干預(yù)后，能明顯改善肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，減緩大鼠體重增長，減輕肝重，降低肝指數(shù)，同時(shí)能改善血質(zhì)紊亂，明顯降低TG、TC、LDLC，升高HDLC，改善ALT、AST。實(shí)驗(yàn)表明在NASH早期，體重增長、血脂代謝的紊亂與肝細(xì)胞脂肪病變有密切的聯(lián)系，女貞子能減輕脂肪沉積、改善血脂紊亂，糾正肝功能，保肝作用明顯。其治療NASH的可能作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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PreventiveEffectofLigustriLucidiFructusonExperimentalNonalcoholicSteatohepatitisRats

YANG Nian-yun1*,WANG Liu-ying2,QIN Huan1,KANG Jia-ning1,XU Hong-mei1,TANG Yu-ping1,LIU Pei1,QIAN Da-wei1

(1.JiangsuKeyLaboratoryforHighTechnologyResearchofTCMFormulae,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210046,China; 2.HailingPharmaceuticalCo.Ltd,YangzijiangPharmaceuticalGroup,Nanjing210049,China)

Objective： To investigate the preventive effect of Ligustri Lucidi Fructus on non-alcoholic steatohepatitis(NASH)rats.Methods： NASH rat model was established by high fat diet feeding combined with hypodermic injection at low dose of CCl4.NASH model group fed high fat diet and Ligustri Lucidi Fructus for 4 consecutive weeks was served as Ligustri Lucidi Fructus intervened group,while the rats in control group were fed normal diet.At the end of experiments,all the rats were sacrificed to analyze ALT,AST,TG,TC,LDLC and HDLC levels in serum.Pathological changes of hepatic tissues were observed under microscope.Results: Compared to normal rats,liver function and lipid levels exhibited an obvious increase in NASH rats and a significant reduction in Ligustri Lucidi Fructus intervened NASH rats(P<0.05).Hepatocyte swelling,as well as neutrophilic infiltration and hepatocyte ballooning exhibited a decrease in Ligustri Lucidi Fructus intervened NASH rats.Conclusion: Ligustri Lucidi Fructus have a significant preventive effect on non-alcoholic steatohepatitis rats,which can alleviate fat deposition,improve lipids disorder,and correct liver dysfunction.

Ligustri Lucidi Fructus; Non-alcoholic steatohepatitis; Preventive effect

2013-03-16)

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教育部科技發(fā)展中心高校博士點(diǎn)基金資助課題(20113237120008)

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楊念云，男，副研究員，研究方向：天然藥物活性成分研究，E-mail:nianyunyang@163.com