金線蓮組織培蕎的條件優(yōu)化研究

王建明，王松良，詹巧杰，古力，康智明，張金榮，林長(zhǎng)芹

(1.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)中藥材GAP研究所，福建 福州 350002)

金線蓮組織培蕎的條件優(yōu)化研究

王建明1，2，王松良1*，詹巧杰1，古力2，康智明1，張金榮1，林長(zhǎng)芹1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)中藥材GAP研究所，福建 福州 350002)

本研究通過(guò)設(shè)置試驗(yàn)優(yōu)化金線蓮組培的條件，試驗(yàn)結(jié)果表明，金線蓮?fù)庵搀w消毒處理以75％乙醇＋0.1％HgCl浸泡處理8min效果較好；增殖繼代培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基添加激素6-BA/2mg·L-1＋NAA/0.5mg·L-1的處理效果最優(yōu)；培養(yǎng)基中添加20％香蕉對(duì)于芽苗的增殖及壯苗的培養(yǎng)均有極大的促進(jìn)作用；液態(tài)培養(yǎng)基顯著優(yōu)于半液態(tài)和固態(tài)培養(yǎng)基；原球莖增殖途徑增殖倍數(shù)高且增殖速度快，但培養(yǎng)出來(lái)的芽苗質(zhì)量較弱小。

金線蓮；組織培養(yǎng)；激素；有機(jī)添加物

金線蓮(Anoectochilus roxborghii(wall.)lind.)為蘭科開(kāi)唇蘭屬多年生草本，又名金絲線、金耳環(huán)、烏人參等是我國(guó)傳統(tǒng)珍貴藥材，素有“金草”、“神藥”等美稱(chēng)[1]。金線蓮性喜陰涼、潮濕，尤其喜歡生長(zhǎng)在有常綠闊葉樹(shù)木的溝邊、石壁、土質(zhì)松散的潮濕地帶，一般分布在海拔300～1 200m的丘陵地。我國(guó)福建、廣東、廣西、臺(tái)灣、四川、貴州、云南均有野生金線蓮。金線蓮的藥用價(jià)值非常之廣。它具有清熱涼血、袪風(fēng)利濕、強(qiáng)心利尿、固腎、平肝等功能。常用于治療咯血、支氣管炎、腎炎、肺炎、糖尿病、風(fēng)濕病、毒蛇咬傷、急慢性肝炎等癥；近年來(lái)，還被用于治療高血壓、腫瘤、心臟病、化膿性骨髓炎、口瘡、性病等[2-4]。金線蓮除藥用外，還是一種極具觀賞價(jià)值的室內(nèi)觀葉珍品[5]。

金線蓮種子微小，自然萌發(fā)率和繁殖率極低。早期市場(chǎng)上貨源主要來(lái)自于野生采挖，極其稀少。近年隨著對(duì)其藥效和臨床應(yīng)用研究的深入，及其營(yíng)養(yǎng)成分不斷被發(fā)現(xiàn)，其藥用價(jià)值及觀賞價(jià)值，得到社會(huì)上更多人的關(guān)注，市場(chǎng)對(duì)于金線蓮的需求急劇上升，其市場(chǎng)價(jià)格也不斷被推高。金線蓮對(duì)生態(tài)環(huán)境要求嚴(yán)格，其自身生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)量極低，加之近年自然環(huán)境遭受?chē)?yán)重破壞，野生金線蓮無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。經(jīng)過(guò)科研人員多年的研究，金線蓮組織培養(yǎng)技術(shù)取得較大的進(jìn)展，目前已實(shí)現(xiàn)較大規(guī)模工廠化育苗和人工栽培。由于金線蓮生長(zhǎng)緩慢，人工育苗的質(zhì)量參差不齊，繁殖率低，生產(chǎn)成本高居不下，培養(yǎng)條件有待改進(jìn)。本研究旨在探索金線蓮組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化，以提高芽苗增殖率及生長(zhǎng)速度及質(zhì)量，為生產(chǎn)者改進(jìn)技術(shù)措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采摘自福建三明的福建野生金線蓮、臺(tái)灣金線蓮組培無(wú)菌苗(福建農(nóng)林大學(xué)金線蓮研究小組提供)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 選取植株完整，生長(zhǎng)粗壯，形態(tài)特征優(yōu)良的野生金線蓮植株，先用大量的清水沖洗去表面附著的泥土腐葉等雜物，去除根、葉(保留頂部葉片)備用。

將預(yù)處理好的野生金線蓮莖先用無(wú)菌水沖洗3次，再進(jìn)行消毒處理。設(shè)置11種處理方法為：(1)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸鈉(10min浸泡)；(2)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸鈉(20min浸泡)；(3)75％乙醇(30 s浸泡)＋0.1％HgCl(5min浸泡)；(4)75％乙醇(30 s浸泡)＋0.1％HgCl(8min浸泡)；(5)75％乙醇(30 s浸泡)＋0.1％HgCl(11min浸泡)；(6)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸鈉(10min浸泡)＋0.1％HgCl(5min浸泡)；(7)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸鈉(10min浸泡)＋0.1％HgCl(8min浸泡)；(8)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸鈉(10min浸泡)＋0.1％HgCl(11min浸泡)；(9)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸鈉(20min浸泡)＋0.1％HgCl(5min浸泡)；(10)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸鈉(20min浸泡)＋0.1％HgCl(8min浸泡)；(11)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸鈉(20min浸泡)＋0.1％HgCl(11min浸泡)。浸泡消毒過(guò)程中輕微振蕩，以提高消毒效果，浸泡處理后，用無(wú)菌水洗4次。

按小組分別將消毒處理后的材料切割成帶一個(gè)節(jié)的莖段(長(zhǎng)約1.5cm)和頂芽帶葉(長(zhǎng)約1.5cm)的外植體，分別接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每瓶接一個(gè)外植體。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS基本培養(yǎng)基，每個(gè)消毒處理接種30瓶，共330瓶。放入培養(yǎng)箱進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃。期間定期進(jìn)行觀察，排查污染瓶，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.2 繼代增殖培養(yǎng)基 選擇MS、1/2MS和N6為3種培養(yǎng)基為A因素，以6-BA＋NAA3種水平組合為B因素設(shè)置兩因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)試驗(yàn)(表1)。每升培養(yǎng)基添加瓊脂8g、蔗糖30g，pH調(diào)至5.6～5.8。接種的金線蓮無(wú)菌苗材料，全都選取生長(zhǎng)狀況相近的莖段。接種后統(tǒng)一放在同一培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，設(shè)置溫度25℃，光照度1500-2000LX，光照時(shí)間12h·d-1。培養(yǎng)時(shí)間為60d后進(jìn)行比較分析。

表1 金線蓮增殖培養(yǎng)基試驗(yàn)因素與水平

1.2.3 有機(jī)添加物 以 MS＋8g·L-1瓊脂＋30g·L-1蔗糖＋6-BA2mg·L-1＋NAA0.5mg·L-1為基本培養(yǎng)基，選擇組培中常用的有機(jī)添加物：香蕉泥、椰子汗、馬鈴薯汁、蛋白胨(配合添加活性碳)等作為添加物，分別設(shè)置兩個(gè)水平，比較各有機(jī)添加物的效果。

具體方法：香蕉去皮后稱(chēng)取所需質(zhì)量加適量水用家用攪拌機(jī)打成香蕉漿，和煮化的瓊脂、蔗糖共同加熱后加入配制好的基本培養(yǎng)基，定容分裝后高壓滅菌；椰子汁以新鮮的椰子取汁，使用經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌的溶劑過(guò)濾器和經(jīng)過(guò)75％酒精消毒的超濾膜真空抽濾除菌，用滅過(guò)菌的量筒量取所需量加入己滅菌冷卻但尚未凝固的培養(yǎng)基中并搖勻，最后分裝到經(jīng)過(guò)高壓滅菌的組培瓶中冷卻凝固；馬鈴薯汁選用質(zhì)量良好的新鮮馬鈴薯塊莖去皮后稱(chēng)取所需質(zhì)量，切片后加適量水煮熟，用粗紗布過(guò)濾，薯汁加入培養(yǎng)基定容分裝后高壓滅菌；蛋白胨添加以稱(chēng)取所需質(zhì)量，和瓊脂、蔗糖共煮后加入基本培養(yǎng)基，分裝滅菌后待用。

接種材料為無(wú)菌叢生苗，每個(gè)處理接種30瓶。培養(yǎng)環(huán)境：溫度25℃，光照2000-3000LX，光照時(shí)間 12h·d-1。培養(yǎng)時(shí)間 60d。

1.2.4 瓊脂添加量 以MS＋6-BA2mg·L-1＋NAA0.5mg·L-1＋30g·L-1蔗糖為基本培養(yǎng)基，以瓊脂添加量為處理，設(shè)置3個(gè)水平8g、4g、0g，考察固態(tài)、半液態(tài)和液態(tài)培養(yǎng)基對(duì)叢芽培殖的影響。接種材料為無(wú)菌叢生苗。培養(yǎng)環(huán)境：溫度25℃，光照2000-3000LX，光照時(shí)間12h·d-1。培養(yǎng)時(shí)間60d。

1.2.5 原球莖和叢生芽增殖比較 金線蓮組培苗的增殖方式通常有圓球莖增殖和叢生芽增殖兩種途徑，本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種途徑的增殖效果及芽苗質(zhì)量進(jìn)行比較。

以 MS＋6-BA2mg·L-1＋NAA0.5mg·L-1＋30g·L-1蔗糖為基本培養(yǎng)基(不添加瓊脂，液態(tài))，分別以圓球莖和無(wú)菌叢生芽為接種材料。培養(yǎng)環(huán)境：溫度25℃，光照2000-3000LX，光照時(shí)間12h·d-1。培養(yǎng)時(shí)間30d。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾種消毒處理效果比較

外植體消毒處理后，經(jīng)過(guò)1個(gè)月時(shí)間培養(yǎng)，其中部分出現(xiàn)污染，未污染的外植體有一部分萌發(fā)出新芽，形成無(wú)菌苗；還有一部分未出現(xiàn)污染，但也不萌發(fā)，這部分材料呈永久休眠狀態(tài)。具體情況見(jiàn)表2。

表2 金線蓮?fù)庵搀w消毒處理效果情況統(tǒng)計(jì)/瓶

試驗(yàn)可知，第(4)組75％酒精(30 s浸泡)＋0.1％HgCl(8min浸泡)的萌發(fā)率最高，達(dá)到50％，優(yōu)于其它參試組。外植體消毒不徹底易產(chǎn)生污染，消毒處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可使金線蓮?fù)庵搀w因其毒害使幼芽出現(xiàn)死亡或進(jìn)入永久休眠狀態(tài)。0.1％HgCl與2.0％次氯酸鈉配合消毒也可提升消毒效果，減少污染瓶數(shù)，但由于較長(zhǎng)時(shí)間的浸泡處理，易引起對(duì)外植體的毒害作用，最終結(jié)果并不理想。

2.2 繼代增殖培養(yǎng)基及激素的影響

不同基本培養(yǎng)基及激素組合，培養(yǎng)90d，每個(gè)組合隨機(jī)抽取10瓶，分別計(jì)算其增殖倍數(shù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析(見(jiàn)表3)。

表3 金線蓮繼代增殖試驗(yàn)結(jié)果的多重比較(增殖倍數(shù))

由表3可見(jiàn)，MS基本培養(yǎng)基增殖倍數(shù)顯著優(yōu)于1/2MS和N6培養(yǎng)基，說(shuō)明MS較適合作為金線蓮組培的基本培養(yǎng)基；激素組合以6-BA/2mg·L-1＋NAA/0.5mg·L-1較好，增殖倍數(shù)最高。其中以 MS為基本培養(yǎng)基添加激素 6-BA/2mg·L-1＋NAA/0.5mg·L-1的處理培殖倍數(shù)最高，達(dá)到6.6倍，極顯著優(yōu)于其他處理(見(jiàn)表4)。

2.3 有機(jī)添加物的效果比較

增殖培養(yǎng)基添加不同有機(jī)物質(zhì)，培養(yǎng)90d，每個(gè)組合隨機(jī)抽取10瓶，分別計(jì)算其增殖倍數(shù)及觀察瓶苗生長(zhǎng)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析(見(jiàn)表5、表6)。

表5 有機(jī)添加物培養(yǎng)瓶苗增殖倍數(shù)差異比較

由表5可見(jiàn)，培養(yǎng)基中添加香蕉泥、椰子汁能提高增殖倍數(shù)，且均達(dá)到顯著水平，其中添加香蕉泥的培養(yǎng)基其增殖倍數(shù)達(dá)到極顯著水平。

由表6可以看出，培養(yǎng)基中添加香蕉泥、蛋白胨，其瓶苗明顯比其他處理更為粗壯，且根系發(fā)達(dá)。其中添加香蕉泥的處理，其增殖倍數(shù)高，而且瓶苗粗狀，是各處理中綜合表現(xiàn)最優(yōu)秀的培養(yǎng)基。

2.4 瓊脂添加量對(duì)叢生芽增殖的影響

由表7可見(jiàn)，減少瓊脂添加量，使培養(yǎng)基呈液態(tài)或半液態(tài)，均有利于瓶苗的增殖及生長(zhǎng)，其中液體培養(yǎng)基增殖倍數(shù)最高。液態(tài)培養(yǎng)基適宜用于叢芽或原球莖的增殖培養(yǎng)，接入的種芽或原球莖不能被液體培養(yǎng)基淹沒(méi)，因此，對(duì)于個(gè)體較小的叢芽或原球莖要求液體培養(yǎng)基裝瓶量較淺。

表6 有機(jī)添加物培養(yǎng)瓶苗生長(zhǎng)狀況比較

表7 瓊脂添加量對(duì)叢生芽增殖的影響

2.5 原球莖和叢生芽增殖效果比較

由表8可見(jiàn)，原球莖增殖擴(kuò)繁倍數(shù)遠(yuǎn)高于叢生芽的增殖倍數(shù)，但原球莖增殖產(chǎn)生的芽苗較為弱小，要形成壯苗，還要經(jīng)過(guò)一代促壯培養(yǎng)才能獲得優(yōu)質(zhì)種苗。

表8 原球莖和叢生芽增殖效果比較

3 小結(jié)與討論

3.1 外植體消毒處理對(duì)金線蓮培養(yǎng)的影響

獲得無(wú)菌系是組培工作的基礎(chǔ)，野生金線蓮生長(zhǎng)在陰暗潮濕的自然環(huán)境中，除了繁多的伴生真菌與細(xì)菌外，還有大量的內(nèi)生菌，這些微生物不易清除，給金線蓮的組培工作帶來(lái)極大的困難；金線蓮肉質(zhì)莖脆弱，化學(xué)清毒過(guò)程對(duì)金線蓮?fù)庵搀w存在較大的傷害，處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，易造成外植體死亡或誘發(fā)其永久休眠，而處理時(shí)間不夠則不易徹底消除微生物，從而影響無(wú)菌系的獲得[7]。本研究中，采用75％乙醇浸泡30 s結(jié)合1％HgCl浸泡8min，獲得較好的消毒效果。

3.2 繼代增殖培養(yǎng)基對(duì)金線蓮培養(yǎng)的影響

不同的基本培養(yǎng)基和激素濃度水平對(duì)金線蓮的繼代增殖培養(yǎng)存在顯著的影響，本研究中MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果顯著優(yōu)于1/2MS和N6培養(yǎng)基。添加激素能顯著促進(jìn)芽苗的增殖與生長(zhǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基添加激素6-BA/2mg·L-1＋NAA/0.5mg·L-1的處理效果最優(yōu)，能獲得較高的增殖倍數(shù)，且培養(yǎng)的芽苗較為粗壯，同時(shí)誘導(dǎo)芽苗生根，可實(shí)現(xiàn)增殖和生根一步完成(因此本研究中不再進(jìn)行根系誘導(dǎo)的試驗(yàn))。

3.3 有機(jī)添加物對(duì)金線蓮培養(yǎng)的影響

不同有機(jī)添加物對(duì)金線蓮組培苗生長(zhǎng)效果存在顯著的差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加香蕉對(duì)于金線蓮芽苗的增殖及壯苗的培養(yǎng)均有極大的促進(jìn)作用。同時(shí)添加激素和香蕉的培養(yǎng)基增殖倍數(shù)高于不添加激素的香蕉培養(yǎng)基，但不添加激素的香蕉培養(yǎng)基獲得的組培苗更為粗壯，對(duì)于由原球莖誘導(dǎo)分化出來(lái)的較細(xì)弱而又?jǐn)?shù)量繁多的叢芽的促壯培養(yǎng)，使用不添加激素的香蕉培養(yǎng)基效果更佳。

椰子汁也是金線蓮組培中常用的有機(jī)添加物，對(duì)芽苗的增殖有較好的效果。但添加椰子汁的培養(yǎng)基對(duì)于培育壯苗效果較差，而且配制椰子汁培養(yǎng)基程序復(fù)雜，操作過(guò)程極易造成培養(yǎng)基的批量污染。

添加蛋白胨的處理雖然增殖倍數(shù)不理想，甚至低于對(duì)照，但其瓶苗生長(zhǎng)粗壯，能夠獲得特別粗壯的單株帶根無(wú)菌苗，為后繼移到瓶外栽培提供理想的壯苗，因此也是一種較為理想的培養(yǎng)基添加物。

3.4 瓊脂添加量對(duì)叢生芽增殖的影響

瓊脂添加量主要影響培養(yǎng)基的硬度及形態(tài)，目前很少人研究其對(duì)金線蓮組培的影響。常用的培養(yǎng)基瓊脂添加量為8g，培養(yǎng)基為固態(tài)；瓊脂添加量減少至4g時(shí)，培養(yǎng)基呈半液態(tài)；不添加瓊脂的培養(yǎng)基則為液態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于叢生芽或原球莖的增殖培養(yǎng)，液態(tài)培養(yǎng)基優(yōu)于半液態(tài)和固態(tài)的培養(yǎng)基，其原因可能是液態(tài)或半液態(tài)培養(yǎng)基與芽苗接觸面大，且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素易于流動(dòng)而利于芽苗吸收利用。

3.5 原球莖和叢生芽增殖培養(yǎng)差異

原球莖增殖和叢生芽增殖是金線蓮組培的兩種增殖途徑，原球莖增殖倍數(shù)遠(yuǎn)高于叢生芽的增殖倍數(shù)。原球莖自身增殖速度較快，又能在較短的時(shí)間內(nèi)分化成數(shù)量繁多的幼苗，這對(duì)于工廠化育苗有較大的實(shí)用意義。原球莖增殖途徑能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的無(wú)菌苗，但這些苗通常較為細(xì)弱，要培養(yǎng)成為適合移栽的壯苗還要經(jīng)過(guò)促壯促根培養(yǎng)。

[1]許文江，陳裕.藥用野生金線蓮植物資源的研究[J].福建熱作科技，2000，25(4)：9-10.

[2]孔祥海.“藥王”金線蓮的自然資源初步研究[J].中草藥 .2001，32(2)：155-157.

[3]馬志杰，胡宏友.民間藥材金線蓮研究動(dòng)態(tài)(綜述)[J].亞熱帶植物科學(xué) .2002，31(B09)：27-31.

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[5]陳漢鑫，王雅英，楊忠耿，等 .金線蓮組織培養(yǎng)快繁技術(shù) [J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，35(4)：325-326.

關(guān)于召開(kāi)“中藥材GAP發(fā)展論壇”暨中國(guó)藥材GAP研究促進(jìn)會(huì)(GAPA)第三次理事會(huì)的通知(第一輪)

1998年11月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局邀請(qǐng)國(guó)家科委、經(jīng)貿(mào)委、中醫(yī)藥局等同志及專(zhuān)家共同商討并提出在我國(guó)推行〈中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GAP)》的命題，隨即成立GAP起草專(zhuān)家組，2002年3月國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局通過(guò)了《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GAP)》(試行)，并于同年6月1日發(fā)布實(shí)施。

迄今，我國(guó)實(shí)施GAP已走過(guò)10年風(fēng)雨征途，中國(guó)藥材GAP研究促進(jìn)會(huì)(GAPA)成立12周年，為了回顧和總結(jié)10年來(lái)中藥材GAP實(shí)施成果，展示中華醫(yī)藥文化的豐富內(nèi)涵，汲取有用的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，更加信心百倍地為中藥標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化和國(guó)際化而繼續(xù)奮斗，為中國(guó)和世界人民的健康事業(yè)作出更大的貢獻(xiàn)，中國(guó)藥材GAP研究促進(jìn)會(huì)擬于2013年第三季度召開(kāi)中藥材GAP發(fā)展論壇暨GAPA第三次理事會(huì)擴(kuò)大會(huì)議，請(qǐng)GAP專(zhuān)家組成員，GAP文本起草小組成員，GAPA理事及會(huì)員屆時(shí)出席會(huì)議，并熱烈歡迎廣大醫(yī)藥工作者，有關(guān)中藥農(nóng)業(yè)、中藥工業(yè)、中藥醫(yī)療，中藥資源教育及臨床等中醫(yī)藥業(yè)各界人士參與研討，共謀發(fā)展。

會(huì)議籌備聯(lián)系人：

夏少杰：025-86612510 13151070912 E-mail：cpuxsj＠163.com

金久寧：025-84347019 13915940171 E-mail：jinjn＠m(xù)ail.cnbg.net

地 址：南京市中山門(mén)外南京中山植物園

郵 編：210014

Study on Condition Optim ization of Tissue Culture for Golden Thread Lotus(GTL)

WANG Jian-ming1，2，WANG Song-liang1，ZHAN Qiao-jie1，GU Li2，KANG Zhi-ming1，ZHANG Jin-rong1，LIN Chang-qin1
(1.College of Crop Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China；2.Institute of GAP for Chinese Medicinal Materials，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China)

This study focused on optimizing tissue culture medium conditions for Golden Thread Lotus.The results showed that：(1)it is better to process the explants of Golden thread lotus by dealing with 75％ethanol for30 sec and then soaking in 0.1％HgCl for 8 minutes than other treatments；(2)it is the bestmedium to be cultured on MS＋6-BA/2mg·L-1＋NAA/0.5mg·L-1for the proliferation of Golden thread lotus；(3)the MSmedium with 20％banana contributed to the proliferation of bud seeding and strong seedling；(4)the effect of liquid medium was better than semi-liquid and solid medium for culture；(5)it is better both in multiples and speed through protocorm proliferation pathway than other pathways，but the bud seeding obtained wasweak.

Golden thread lotus(GTL)；Tissue culture；Hormone；organic additive

2012-09-18)

*[通訊作者]王松良，wsoloedu07＠126.com