紫外分光光度法測(cè)定巴豆中總生物堿的含量△

金鋒，張振凌*，任玉珍，陳彥琳，杜杰，周林，白宗利，梁煥

(1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008；2.中國(guó)藥材公司，北京 102600)

紫外分光光度法測(cè)定巴豆中總生物堿的含量△

金鋒1，張振凌1*，任玉珍2*，陳彥琳2，杜杰2，周林2，白宗利2，梁煥2

(1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008；2.中國(guó)藥材公司，北京 102600)

目的：建立紫外分光光度法測(cè)定巴豆中總生物堿含量的方法。方法：采用紫外分光光度法，以巴豆苷為對(duì)照，在292nm波長(zhǎng)處進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：巴豆苷在3.84～23.04μg·mL-1與吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程Y＝0.036 5X-0.029 7，r＝0.999 9(n＝6)，平均加樣回收率為101.38％，RSD＝1.21％。結(jié)論：本測(cè)定方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、靈敏、快速、重現(xiàn)性好，可以作為控制巴豆及巴豆霜質(zhì)量的方法與指標(biāo)。

巴豆；總生物堿；含量測(cè)定；紫外分光光度法

巴豆為大戟科喬木植物巴豆Croton tiglium L.的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于四川、廣西、云南、貴州等地，為較常用川產(chǎn)道地中藥材。生巴豆味辛、性熱，有大毒，歸胃、大腸經(jīng)，外用蝕瘡，內(nèi)服多制霜用，具有峻下積滯，逐水消腫，豁痰利咽的功能[1]。巴豆主要含有機(jī)酸及甘油酯類成分、生物堿類成分及植物蛋白類成分，其中，巴豆總生物堿的生理活性顯著，有顯著的抗癌作用[2-4]，對(duì)甲狀腺癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤都具有治療作用[5]。田艷偉[6]發(fā)現(xiàn)巴豆水提液具有顯著的誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向正常方向分化的作用，甲醇提取物可以顯著抑制HIV-1病毒的傳染性[5]，說(shuō)明巴豆生物堿多集中在親水性部位，但目前文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道巴豆生物堿的具體化學(xué)成分組成，因此有必要對(duì)總生物堿成分進(jìn)行測(cè)定。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道了巴豆總生物堿的含量測(cè)定方法[7]，但我們此次建立的新方法，對(duì)總生物堿提取完全，精密度、重現(xiàn)性等較好，方法更加簡(jiǎn)便、快速。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV2802-pc紫外分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)，Waters2695高效液相色譜儀，TB-215D型十萬(wàn)分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，HH-4電熱恒溫水浴鍋(江蘇常州國(guó)華電器有限公司)，F(xiàn)W-100高速粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)，KQ2100DB超聲波清洗器(浙江昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

巴豆苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：11856-201001)；乙醚、硫酸、甲醇(北京化工廠)，均為分析純；色譜級(jí)甲醇、乙腈(FisherScientific)，水為雙蒸水。巴豆藥材經(jīng)北京市中醫(yī)學(xué)校金世元教授鑒定為大戟科植物巴豆Croton tiglium L.的干燥成熟果實(shí)。巴豆藥材來(lái)源及批號(hào)見(jiàn)表1。

表1 巴豆藥材來(lái)源批次表

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取巴豆苷對(duì)照品適量，精密稱定，加水配制成76.8μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取巴豆種仁粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.3g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚50mL，加熱回流3h，棄去乙醚液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入具塞錐形瓶中，精密加入1％的硫酸溶液50mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率24 kHz)30min，放冷，再稱定重量，用1％的硫酸溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取濾液1mL加1％的硫酸溶液定容至10mL，搖勻，備用[1]。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，見(jiàn)圖1和圖2。結(jié)果顯示兩者都在292nm附近有最大吸收，故選擇292nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 巴豆生物堿部位紫外掃描圖

圖2 巴豆苷對(duì)照品紫外掃描圖

2.4 線性關(guān)系的考察

精密量取巴豆苷對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL移入10mL容量瓶中，加水至刻度。以水為空白在292nm下測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝0.036 5X-0.029 7，r＝0.999 9(n＝6)。結(jié)果表明，樣品液在 3.84～23.04μg·mL-1呈線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取供同一供試品溶液，于292nm下重復(fù)測(cè)定6次，其吸光度的RSD＝0.21％，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按上述方法在1，2，3，4，5，6h時(shí)分別測(cè)定吸光度，其RSD＝0.29％，表明供試品溶液在6h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一樣品6份，按2.3制備成供試品溶液，在292nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算含量，其RSD＝0.78％，表明重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一樣品粉末6份，每份0.15g，精密稱定，分別精密加入適量巴豆苷對(duì)照品，按2.3制備供試品溶液，按上述方法測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 巴豆苷加樣回收率試驗(yàn)

2.9 樣品含量測(cè)定

按照《中國(guó)藥典》2010版一部“巴豆”項(xiàng)下巴豆苷測(cè)定方法測(cè)定藥材中巴豆苷的含量[1]，按照2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，并依照建立的方法測(cè)定3個(gè)不同來(lái)源的巴豆藥材的總生物堿含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 巴豆中巴豆苷與總生物堿含量測(cè)定結(jié)果(n＝2)/％

3 討論

在供試品溶液的制備過(guò)程中，考察了不同提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間以及料液比對(duì)總生物堿含量的影響，發(fā)現(xiàn)用50mL的1％硫酸超聲提取30min，可以將0.3g樣品中總生物堿提取完全。

曾寶等[7]以自提的木蘭花堿為對(duì)照采用酸性染料法測(cè)定巴豆中總生物堿含量，本課題組認(rèn)為木蘭花堿是毛茛科植物粗果唐松草的根莖中主要的活性物質(zhì)，在花椒、淫羊藿等植物中均有發(fā)現(xiàn)，不是巴豆的特異性成分，該法提取的總生物堿含量最高僅為0.42％，但巴豆苷作為巴豆生物堿的1種，《中國(guó)藥典》2010版規(guī)定其含量不低于0.80％[1]，雖然含量測(cè)定方法不同，但是單體含量不太可能高于有效部位的含量，推測(cè)是因?yàn)樵摲椒ú捎?0％的乙醇提取，部分水溶性較強(qiáng)的成分未提取完全所致。

本法以巴豆的指標(biāo)性成分巴豆苷為對(duì)照，采用紫外分光光度法測(cè)定巴豆中總生物堿的含量，供試品前處理方法與《中國(guó)藥典》巴豆苷的提取方法相似，容易掌握，且能將生物堿提取完全，能夠簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定巴豆總生物堿的含量，可以作為控制巴豆及巴豆霜質(zhì)量的方法。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：74.

[2]王明艷，瞿融，許冬青.巴豆生物堿誘導(dǎo)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(9)：368-369.

[3]陳武，陳鵬英，劉鵬，等.巴豆生物堿對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡及Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，11(6)：17.

[4]趙小迎，陳俊，蔡平生.巴豆生物堿抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2010，13(21)：13-20.

[5]劉秀德，隋在云.巴豆總生物堿對(duì)癌細(xì)胞質(zhì)膜流動(dòng)性及胞漿基質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，14(3)：192-194.

[6]田艷偉.巴豆水提取液對(duì)HL-60細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用[J].山西醫(yī)藥雜志，2002，31(3)：265.

[7]曾寶，李生梅，古俊輝，等.酸性染料法測(cè)定巴豆中總生物堿的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，28(2)：170-172.

Determ ination of Total A lkaloids in Crotonis Fructus by Ultraviolet Spectr-ophometry

JIN Feng1，ZHANG Zhen-ling1，REN Yu-ren2，CHEN Yan-lin2，DU jie2，ZHOU Lin2，BAIZong-li2，LIANG Huan2
(1.Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China；2.China National Corp.of Traditional＆Herbal Medicine，Beijing 102600，China)

Objective：To establish a simple method for determination Alkaloids contents from Crotonis Fructus.M ethods：Adopting Crotonoside as reference，alkaloids in Crotonis Fructus were detected by ultraviolet spectrophotometry at292nm.Results：The liner arrange of crotonoside was 3.84～23.84μg·mL-1(Y＝0.036 5X-0.029 7，r＝0.999 9).The mean recovery of crotonoside was 101.38％(RSD＝1.21％).Conclusion：The method is accurate，simple，quick，sensitive and reproducible.

Crotonis Fructus；Total Alkaloids；Content determination；Ultraviolet spectr-ophometry

2012-07-10)

2011年中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)——附子等中藥炮制方法傳承與規(guī)范化應(yīng)用研究(201107008)

*[通訊作者]張振凌，Tel：(0371)65680970，E-mail：zhangzl7658＠163.com；任玉珍，E-mail：renjl2008＠163.com