酸度對葉酸熒光強度影響的設計實驗

王玉芹 丁益民 曹志源 饒薇薇 張慧

(上海大學理學院化學系 上海 200444)

儀器分析課程是我系應用化學專業(yè)的專業(yè)必修課，與之相配套的實驗課可以使學生將理論知識與實踐緊密地結合起來，建立起嚴格的量的概念。在儀器分析實驗內容的選定上，我們不斷補充新的知識，如催化動力學、熒光分析、化學發(fā)光分析等，使學生及時了解目前有關分析法的前沿知識、發(fā)展動態(tài)和新的分析手段。在教學中，我們不斷引入新的知識內容，及時更換實驗講義，目的不僅是要使學生學會儀器分析方法、掌握大型儀器的基本操作技能，而且還要提高學生運用所學知識分析、解決實際問題的綜合能力。

葉酸(folic acid)是一種廣泛存在于綠色蔬菜中的B族維生素，在人體內參與氨基酸及核酸的合成，并能與維生素B12共同促進紅細胞的生成。國外研究人員發(fā)現(xiàn)，葉酸可引起癌細胞凋亡，對癌細胞的基因表達有一定影響[1-2]。

本實驗的設計是在結合熒光分析法的基礎上，引入目前較受關注的葉酸，以激發(fā)學生的實驗興趣。通過本實驗，學生不僅可以掌握熒光分光光度計的測試原理和基本操作，還可以學習熒光分析法在實際生活中的應用，從而更加有利于實驗教學的開展和增強學生的學習效果。

1 實驗設計目的

(1) 學習配制不同pH的緩沖溶液。

(2)了解熒光分光光度計的基本原理、結構及性能，掌握其基本操作。

(3) 了解熒光光譜測試的影響因素，并用標準曲線法定量分析保健品中的葉酸含量。

2 實驗原理

2.1 熒光的測試原理

熒光光譜法是利用物質吸收可見-紫外光成為激發(fā)態(tài)而又去活化過程(返回到原來基態(tài)的過程)發(fā)生的光輻射現(xiàn)象。熒光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜，它們是熒光定性分析的基礎。溶液的熒光測量是在與激發(fā)光垂直的方向進行的，圖1為熒光分光光度計的結構示意圖。

圖1 熒光分光光度計結構示意圖

熒光定量分析的數(shù)學處理比分子吸收光譜復雜。一般來講，熒光強度If等于分子所吸收輻射的光強度Ia與量子效率φ的乘積，即If=φf·Ia=φf·I0(1-10-εbc)。如果熒光物質的濃度足夠低，則If=2.3φf·I0εbc=kc(式中ε、b、c分別是摩爾吸光系數(shù)、比色皿厚度及被測物質的濃度)。這表明被測物質的濃度與熒光強度成正比，這就是熒光定量分析的理論基礎。

2.2 葉酸的熒光性能

葉酸微溶于水，其鈉鹽在水中溶解度較大；葉酸在中性及堿性溶液中比較穩(wěn)定，在酸性溶液中加熱易分解。葉酸稀溶液的熒光比較弱，直接測定靈敏度不高。在濃度為1×10-4～1×10-5mol·L-1的水溶液中，葉酸的最大激發(fā)光譜為365nm，最強發(fā)射峰位于449nm。在入射和出射狹縫均為5nm時，濃度為1×10-4mol·L-1的葉酸水溶液的激發(fā)和發(fā)射光譜見圖2。

圖2 葉酸水溶液的激發(fā)和發(fā)射光譜

據(jù)報道[3]，葉酸與高錳酸鉀反應生成強熒光產物喋呤(C7H4N5O3),其熒光強度比葉酸大很多。葉酸光照后的熒光強度變化情況與此類似,在中性和弱堿性介質環(huán)境中、紫外線作用下會發(fā)生光化學發(fā)應，生成了強熒光喋呤類物質，主要成分是喋呤-6-羧酸和喋呤-6-甲醛(圖3)。因此可以通過熒光燈照射的方法增強葉酸熒光強度，提高實際樣品中葉酸含量分析的靈敏度。

圖3 葉酸生成強熒光喋呤類物質的反應

3 實驗內容

3.1 儀器

RF-5301PC熒光分光光度計(島津)，pH計，電子天平，手持熒光燈，容量瓶，棕色玻璃瓶，燒杯，移液管。

3.2 試劑

葉酸(BR)，磷酸氫二鈉(AR)，磷酸二氫鉀(AR)，氫氧化鈉(AR)，鐵質葉酸片(安利紐崔萊)。

3.3 實驗步驟

3.3.1 緩沖溶液的配制

A液：0.0667mol·L-1磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液的配制。準確稱量9.465g磷酸氫二鈉，用高純水溶解，定容于1000mL容量瓶中。

B液：0.0667 mol·L-1磷酸二氫鉀(KH2PO4)溶液的配制。準確稱量9.070g磷酸二氫鉀，用高純水溶解，定容于1000mL容量瓶中。

將A，B液分別保存在棕色玻璃瓶中，冷藏于4℃冰箱中，使用時按不同比例混合，利用pH計測量，即可得到不同pH的PBS緩沖溶液[4](表1)。

表1 PBS緩沖溶液的配制

3.3.2 葉酸溶液的熒光測試

(1) 將葉酸分別溶解在pH為5.91、7.38和8.04的PBS緩沖溶液中，配制出3種濃度為1×10-4mol·L-1葉酸溶液，避光靜置30min后，測試其熒光發(fā)射光譜。

(2) 在暗處用發(fā)射波長為365nm的熒光燈(中心波長濾色片為150mm×50mm，功率為8W)照射上述3種pH的葉酸溶液1h，再避光靜置30min，分別測試其熒光發(fā)射光譜。

3.3.3 標準曲線法定量分析葉酸含量

(1) 葉酸標準溶液(2mg·L-1)的配制：準確稱取2mg葉酸標準品，加入幾滴0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液助溶于燒杯中，充分溶解后轉移至容量瓶，用蒸餾水定容至1000.00mL。準確吸取0.00(空白樣)，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00mL葉酸標準溶液，分別置于10.00mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。在暗處用發(fā)射波長為365nm的熒光燈照射上述葉酸溶液1h，在Ex=365nm，Em=449nm處測定熒光強度。以熒光強度為縱坐標，葉酸的含量為橫坐標，繪制標準曲線。

(2) 待測樣品的配制：取0.3g研細的鐵質葉酸片樣品(約含葉酸66μg)，加入幾滴0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液于燒杯中，再轉移至容量瓶中,用蒸餾水定容至50.00mL。準確吸取5.00mL樣品母液，置于10.00mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到待測樣品溶液。

(3) 待測樣品的測定：用發(fā)射波長為365nm的熒光燈暗處照射待測樣品溶液1h后，在Ex=365nm，Em=449nm處測定樣品的熒光強度，在標準曲線上找出對應的含量，以此求出鐵質葉酸片中的葉酸含量。

4 數(shù)據(jù)處理

(1) 分別標出3種pH下葉酸熒光光譜的波長。

(2) 用熒光燈照射后，記錄3種葉酸溶液的熒光峰位置和強度的變化。

(3) 根據(jù)儀器所繪標準曲線，記錄待測樣品溶液的濃度，并計算鐵質葉酸片中葉酸的含量。

5 實踐情況

5.1 課程安排

(1) 本實驗項目被編入冬季儀器分析實驗講義，只對化學系具有一定實驗技能的高年級學生開放，為自愿選修實驗。

(2) 本實驗設為8課時，分成儀器培訓和實踐操作兩部分，一般為6～8個學生一組進行。

5.2 實踐效果

經(jīng)過2009和2010兩個學年的實踐證明，學生都已具有理論及基礎實驗課程的知識積累，對于大型精密儀器的引入頗感興趣，學習和操作的積極性較高。

(1) 在儀器培訓階段，通過實踐學習，能夠熟練操作儀器的學生在課后可以申請進行考核，經(jīng)教師確認其已具有獨立操作能力后，頒發(fā)操作證。有樣品測試要求的學生憑操作證即可預約時間自行測試。

(2) 在配制溶液階段，大家分工合作，每個小組只配制一種酸度的緩沖溶液，實驗時可以相互借用。在儀器操作階段，由于時間寬裕和人數(shù)適當，大家都能有多次的操作機會，從而可以在實際過程中真正掌握儀器的操作，讓大型儀器在教學過程中得到充分應用。

(3) 由于儀器分析實驗使用的都是大型精密儀器，面對的都是高年級學生，所以不設緒論課；對于實驗報告的書寫也沒有統(tǒng)一格式，既可以按傳統(tǒng)方式完成，也可以通過查閱相關文獻，最終結合實驗內容提交電子版實驗報告。

(4) 此次課程的開設還有望為接下來做畢業(yè)論文設計的學生及早做出定位，選擇自己感興趣的課題。比如學習了熒光分光光度計后，希望做發(fā)光材料改性研究方向的學生就可以利用課余時間查文獻，到相關課題組實習，為畢業(yè)論文工作的開展提前打好基礎。

參 考 文 獻

[1] Licciardi M,Giammona G,Du J,etal.Polymer,2006,47:2946

[2] Andrew R H,Philip S L.JPharmSci,2005,94(10):2135

[3] Wittle E L,O′Dell B L,Vandenbelt J M,etal.JAmChemSoc,1947,69(7):1786

[4] 張國旺.水溶性CdTe納米粒子的制備及其熒光性能.上海大學化學系碩士學位論文，2008