李仕勇 范美蘭 馮文科

呼吸道感染是兒科常見疾病，其在臨床發(fā)生率較高，對(duì)患兒和家屬帶來較大的不利影響［1，2］。隨著醫(yī)學(xué)研究水平的不斷深入，對(duì)于基因多態(tài)性的研究也在不斷深入。兒童反復(fù)呼吸道感染是否與維生素D水平及受體基因單核苷酸多態(tài)性有一定的相關(guān)性逐漸引起臨床的廣泛重視。筆者通過對(duì)廣東省陽春市婦幼保健院兒童反復(fù)呼吸道感染病例臨床資料進(jìn)行觀察和分析如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本院2012年2月至2013年2月兒科收治的反復(fù)呼吸道感染患兒50例作為觀察組，其中男27例，女23例，年齡8～13歲，平均年齡(10.3±2.3)歲，50例病例均有不同程度的反復(fù)呼吸道感染臨床癥狀。同時(shí)選取同期本院健康體檢100例作為對(duì)照組，其中男64例，女36例，年齡7～14歲，平均年齡(10.8±2.8)歲。兩組研究對(duì)象的一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 試劑與方法

1.2.1 抽取研究對(duì)象空腹外周血，采用ELISA法測(cè)定25-羥維生素D(25-OH-Vit D)水平，比較反復(fù)呼吸道感染患兒與健康兒童的25-羥維生素D(25-OH-Vit D)水平，分析反復(fù)呼吸道感染與不同25-羥維生素D(25-OH-Vit D)水平的關(guān)系。

1.2.2 試劑 上海復(fù)生生物有限公司生產(chǎn)的Taq DNA聚合酶、dNTPs、Markers，蛋白酶 K、Fok I、Bsm I、Apa I三個(gè)位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶。

1.2.3 DNA的提取為兒童反復(fù)呼吸道感染病例和對(duì)照組外周靜脈血液3.0 ml，通過酚-氯法對(duì)DNA提取，保存于-20℃冰箱。參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物的合成［3］，Bsm I上游引物為5，-AACCAAGACTACAAGTACCGGGTCAGTGA-3，下游引物為5，-TGGCGGCAGCGGATGTACGTCTGC-3，．Fok I上游引物5，AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3，下游引物 5，ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC3，Apa I上游引物 5，CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3，下 游 引 物 5，TGGCGGCAGCGGATGTACGTCTGC-3，

1.2.4 方法 通過PCR-RFLP技術(shù)對(duì)維生素D受體基因多態(tài)性進(jìn)行分析，PCR反應(yīng)體系為50 μl，循環(huán)參數(shù)為94℃進(jìn)行預(yù)變性 10 min，94℃變性 1 min，65℃進(jìn)行退火 1 min，72℃延伸90 s，循環(huán)35次，72℃延伸7 min，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳。

1.2.5 結(jié)果判定 Bsm I多態(tài)性判定，對(duì)PCR產(chǎn)物酶切后只有825bp一個(gè)條帶，提示擴(kuò)增的片段無Bsm I酶切位點(diǎn)，通過BB表示，如果顯示為825bp、650bp、175bp三個(gè)條帶說明有一個(gè)染色體上無酶切位點(diǎn)，另一個(gè)染色體上有酶切位點(diǎn)通過Bp表示，如果顯示650bp和175bp條帶，提示兩個(gè)染色體上均有Bsm I酶切位點(diǎn)，通過bb表示。Fok I多態(tài)性判定，對(duì)PCR產(chǎn)物酶切后只有265bp一個(gè)條帶，說明擴(kuò)增的DNA片段無FokI酶切位點(diǎn)，通過FF表示，如果顯示265bp、196bp、69bp三個(gè)條帶提示擴(kuò)增片段為雜合子，通過Ff表示，如果顯示196bp、69bp兩個(gè)條帶，提示為兩個(gè)染色體上均存在FokI酶切位點(diǎn)為純合子，通過ff表示。Apa I多態(tài)性判定，對(duì)PCR產(chǎn)物酶切后只是顯示740bp一個(gè)條帶為無ApaI酶切位點(diǎn)的純合子，通過AA表示，出現(xiàn)740bp、520bp、220bp三個(gè)條帶為只有一個(gè)染色體上出現(xiàn)酶切位點(diǎn)的雜合子為Aa表示，520bp、220bp兩個(gè)條帶為均有酶切位點(diǎn)的純合子通過aa表示。

1.2.5 兩組研究對(duì)象均通過Hardy-Weinberg遺傳平衡試驗(yàn)，通過基因型分布檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 觀察兩組研究對(duì)象25-羥維生素D(25-OH-Vit D)水平情況。

1.3.2 觀察兩組研究對(duì)象維生素D受體基因型和基因頻率分布情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 15.0建立數(shù)據(jù)庫，計(jì)數(shù)資料通過卡方檢驗(yàn)分析，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象25-羥維生素D(25-OH-Vit D)水平情況(如表1)反復(fù)出現(xiàn)呼吸道感染患兒的觀察組的25-羥維生素D(25-OH-Vit D)水平明顯低于對(duì)照組，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組研究對(duì)象25-羥維生素D(25-OH-Vit D)水平情況

2.2 兩組研究對(duì)象維生素D受體基因型和基因頻率分布情況(如表2、3、4)反復(fù)呼吸道感染患兒的觀察組BsmI基因型Bb、bb頻率明顯高于對(duì)照組，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 兩組研究對(duì)象維生素D受體Bsm I 基因頻率分布情況

表3 表3兩組研究對(duì)象維生素D受體Fok I基因頻率分布情況(%)

表4 兩組研究對(duì)象維生素D受體Apa I基因頻率分布情況［n(%)，%］

3 討論

反復(fù)呼吸道感染是兒科常見性疾病和多發(fā)性疾病，其約占呼吸道感染總發(fā)生率的30%，對(duì)兒童身心造成嚴(yán)重的影響，因其反復(fù)復(fù)發(fā)機(jī)制探討不是十分清楚［4，5］。近年來隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，對(duì)于反復(fù)呼吸道感染患兒基因探討也逐漸增多，尤其是對(duì)于維生素D作用的不斷深入［6，7］。維生素D受體屬于具有生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子，是類固醇激素/甲狀腺素受體超家族的成員之一，其在結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)具有很好的調(diào)節(jié)作用，其在維持機(jī)體鈣磷代謝、細(xì)胞增殖分化具有重要的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反復(fù)出現(xiàn)呼吸道感染患兒的觀察組的25-羥維生素D(25-OH-Vit D)水平明顯低于對(duì)照組，提示25-羥維生素D水平降低可能和兒童反復(fù)呼吸道感染有著一定的相關(guān)性。隨著對(duì)于反復(fù)呼吸道感染患兒維生素D受體水平探討和基因多態(tài)性的探討也逐漸增多［8］。維生素D不僅對(duì)機(jī)體鈣代謝、磷代謝有較好的作用以外，其對(duì)于機(jī)體細(xì)胞增長(zhǎng)、分化及免疫功能調(diào)節(jié)也有重要的作用。維生素D受體屬于親核蛋白，屬于類固醇激素/甲狀腺受體超家族的成員，受體和1，25-(OH)2D3結(jié)合后，其結(jié)合靶基因上游啟動(dòng)子或者是調(diào)控區(qū)域的DNA序列，再靶細(xì)胞胞核作用，進(jìn)而出現(xiàn)一系列的生物效應(yīng)?；騿魏塑账岫鄳B(tài)性主要是指一個(gè)生物群體同時(shí)存在兩種或者多種不連續(xù)變異型或者基因型或者等位基因，期屬于基因單核苷酸上的一種變異，多發(fā)生于基因序列中不編碼蛋白的區(qū)域和沒有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域?；騿魏塑账岫鄳B(tài)性往往具有雙重的意義，其一基因單核苷酸多態(tài)性可能是有害性的突變，逐步演變?yōu)榭蛇z傳的病因，另外一方面基因單核苷酸多態(tài)性作為較好的遺傳標(biāo)記，其再遺傳病的研究中發(fā)揮較為重要的作用。維生素D受體基因多態(tài)性位點(diǎn)主要有四個(gè)，為限制性內(nèi)切酶 Apal、BsmI、TaqI、FokI酶切位點(diǎn)。有資料顯示，維生素D受體屬于核內(nèi)受體，期編碼基因定位于12q13，其主要有8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子組成，其存在多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，其多用 b、a、t、f表示多態(tài)性位點(diǎn)，同時(shí)用 B、A、T、F 表示缺乏4中內(nèi)切酶的多態(tài)性位點(diǎn)。其中BsmI主要是通過調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性和數(shù)目，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)功能的，其可以影響增強(qiáng)子對(duì)于靶器官部位的親和力和影響維生素D的親和力。本研究分別對(duì)兩組研究對(duì)象的Apal、BsmI、FokI三個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切，觀察兩組研究對(duì)象在三個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性情況。結(jié)果表明，兩組研究對(duì)象在FokI兩個(gè)酶切位點(diǎn)的基因型分布上無明顯差異，但是兩組在BsmI基因型分布上有明顯的差異性，反復(fù)呼吸道感染患兒的觀察組BsmI基因型Bb、bb頻率和Apal基因型aa頻率明顯高于對(duì)照組，提示維生素D受體BsmI和Apal基因多態(tài)性可能是誘導(dǎo)呼吸道感染反復(fù)發(fā)生的重要誘因，或者可以說攜帶有Bb、bb及aa基因型可能成為兒童呼吸道反復(fù)感染的易感因素。綜上所述，臨床上應(yīng)加強(qiáng)對(duì)于呼吸道反復(fù)感染患兒BsmI和Apal基因型的篩查，為指導(dǎo)臨床用藥提供理論依據(jù)，進(jìn)而提高臨床治療療效。

［1］ 邢文華，霍洪軍，楊學(xué)軍，等，維生素D受體基因多態(tài)性和椎間盤退變的相關(guān)性研究進(jìn)展．中國脊柱脊髓雜志，2011，21(1)：78-80.

［2］ 劉瓊，黃建生，徐平平，等，維生素D受體基因TagⅠ和BsmⅠ位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與種植體周圍炎的易感性研究．廣東牙病防治，2011，19(5)：249-253.

［3］ AndrewRB，Donald PM，MarkH，eta．l Cloning and expression of full-length cDNA encodinghuman D receptor．ProcNatlAcadSc，i 1988，85：3294.

［4］ 田雨，徐莉，孟煥新，等，侵襲性牙周炎維生素D受體基因多態(tài)性的FBAT分析．北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，42(1)：28-32.

［5］ 曾俐敏，栗平，內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙族和漢族維生素D受體基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松相關(guān)性分析．慢性病學(xué)雜志，2010，12(1)：21-22.

［6］ 鄭敏，羅建明，廣西地區(qū)兒童維生素D受體基因BsmI和Tru9I酶切位點(diǎn)多態(tài)性分布．實(shí)用兒科臨床雜志，2010，25(10)：513-515.

［7］ 李生強(qiáng)，葛繼榮，謝麗華，等，福州地區(qū)漢族婦女絕經(jīng)后維生素D受體基因BsmⅠ多態(tài)性與骨密度的關(guān)系．福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，42(3)：250-252.

［8］ 王振華，李麗紅，魯繼榮，等，維生素D受體基因多態(tài)性與小兒反復(fù)呼吸道感染的相關(guān)性研究．中國實(shí)用兒科雜志，2008，23(4)：304-305.