益經(jīng)湯對卵巢早衰大鼠作用的實驗研究

張廣梅，任世存，王仁嬡，趙協(xié)慧，灑玉萍，趙艷霞，康文娟，李永平

(青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810001)

卵巢早衰是婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域的常見病，是一種病因復雜、治療困難、給患者造成巨大痛苦的疾病，目前還沒有明確的、有效的針對恢復卵巢自然功能的治療方法。西醫(yī)多采用雌孕激素的人工周期療法，但用藥后的副作用使患者難以長期堅持，使用的禁忌證又使一部分患者無法治療。臨床和實驗研究證實，中藥對卵巢有多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)的整體調(diào)節(jié)作用。因此，辨證論治運用中藥比單純應用西藥針對雌激素水平降低的干預措施有著明顯優(yōu)勢并且能夠避免性激素帶來的不良反應與依賴性。

我們選用明末清初著名的醫(yī)學家傅山的《傅青主女科》中治療“年未老經(jīng)水斷”的益經(jīng)湯［1］，對雷公藤多苷片灌胃導致的卵巢早衰模型大鼠進行治療，并通過與空白組、中藥對照組及模型組間FSH、E2的檢測、卵巢組織形態(tài)學變化的觀察，了解益經(jīng)湯對卵巢早衰的作用效果，揭示益經(jīng)湯治療卵巢早衰的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

雷公藤多苷片(每片10mg，湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司，批號20101201，國藥準字Z43020138);益經(jīng)湯(青海省中醫(yī)院藥劑科提供)組成:熟地黃30g，白術(shù)30g，山藥 15g，當歸 15g，白芍 15g，生棗仁 9g，沙參 9g，牡丹皮6g，黨參6g，柴胡6g，杜仲3g，水煎后去渣，濃縮至每毫升含生藥1g，4℃冰箱恒溫保存;六味地黃丸(青海寶鑒堂國藥有限公司，批號 WJ631059，國藥準字Z63020070);性激素化學發(fā)光免疫分析試劑盒(西門子公司)。

1.2 實驗動物

SD雌性大鼠，12周齡，體質(zhì)量250～270g，由青海省地方病實驗動物中心提供。適應性喂養(yǎng)2～3天，連續(xù)5～10天做陰道涂片，有動情周期的大鼠納入實驗組。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 將納入實驗組的動物隨機分組，每組10只，即空白組，模型組，益經(jīng)湯高、低劑量組，中藥對照組。

1.3.2 造模 空白組每天生理鹽水20mL/kg灌胃，其余各組均用雷公藤多苷片50mg/kg灌胃造模，每日1次，連續(xù)灌胃14天。

1.3.3 給藥方法

空白組:喂普通飼料+生理鹽水9mL/kg灌胃;模型組:造模后喂普通飼料+生理鹽水9mL/kg灌胃;益經(jīng)湯低、高劑量組:造模后喂普通飼料+益經(jīng)湯水煎液(按人鼠換算計量)灌胃。高劑量組造模結(jié)束后24h用益經(jīng)湯24g/kg灌胃，每日1次;低劑量組造模結(jié)束后24h用益經(jīng)湯12g/kg灌胃，每日1次。中藥對照組:造模后喂普通飼料+六味地黃丸水溶液20mL/kg/d灌胃。

益經(jīng)湯高、低劑量組和中藥對照組分別連續(xù)治療20天，在末次治療24h后，五組大鼠腹主動脈取血測檢測指標，斷頸處死大鼠，剖腹取卵巢。

1.4 觀測指標

1.4.1 觀察大鼠動情周期

光鏡觀察大鼠陰道脫落細胞的變化來判定動情周期。

1.4.2 大鼠血清性激素(FSH、E2)水平檢測

大鼠用20%的烏拉坦2～5ml麻醉后，腹主動脈取血，置一干凈試管中，放入室溫自然靜置30min后，以3 000r/min速度離心，取上清液于－80℃冰箱保存，用化學發(fā)光免疫法測定FSH、E2值。

1.4.3 大鼠卵巢組織形態(tài)學觀察

采血后斷頭法處死動物，摘取卵巢，剔除脂肪和其他組織，放入天平精確稱取其重量;并將卵巢固定、包埋、切片、HE染色，進行組織學檢查。

1.5 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 大鼠陰道脫落細胞涂片

將細棉簽用生理鹽水浸濕，插入大鼠陰道內(nèi)輕輕轉(zhuǎn)動后取出。將分泌物涂在玻片上，95%乙醇固定20min，巴氏染色法染色?？瞻捉M見大而無核的角化細胞為動情期，每只大鼠的動情期為平均每次4～5天;模型組為平均每次7～8天。中藥高、低劑量、六味地黃丸組依次為平均每次4～5天，6～7天，5～6天。

2.2 血清性激素水平檢測 結(jié)果見表1。

表1 大鼠血清E2、FSH結(jié)果(±s)

表1 大鼠血清E2、FSH結(jié)果(±s)

注:與空白組比較，*P＜0.05;與模型組比較，▲P＜0.05;與六味地黃丸組比較，#P＜0.05。

組別 n E2(pg/mL) FSH(mIU/mL)空白組0.0209 ±0.0034 10 84.47 ±22.67 0.0279 ±0.0028模型組 10 53.79 ±26.02* 0.0143 ±0.0014六味地黃丸組 10 64.85±30.41▲ 0.0160±0.0038益經(jīng)湯低劑量組 10 69.82±27.58▲ 0.0124±0.0013益經(jīng)湯高劑量組 10 78.54±22.91▲#

由表1可知，模型組E2水平降低與空白組比較，其差異有統(tǒng)計學意義;治療后E2水平升高，以益經(jīng)湯高劑量組為最顯著(P＜0.05);FSH各組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 卵巢組織形態(tài)學結(jié)果

光鏡觀察:大鼠卵巢組織形態(tài)學病理分析:1)空白組:卵巢體積大，卵巢皮質(zhì)內(nèi)見多量初級卵泡及生長卵泡，黃體發(fā)育好，體積大，黃體細胞豐富，間質(zhì)及纖維血管少、間質(zhì)腺少見(圖1)。2)模型組:卵巢體積縮小，卵巢皮質(zhì)內(nèi)見少量初級卵泡及生長卵泡，黃體數(shù)量少，閉鎖卵泡多，可見較多間質(zhì)、纖維血管、間質(zhì)腺(圖2)。3)中藥高劑量組、中藥低劑量組、六味地黃丸組:卵巢皮質(zhì)內(nèi)見大量初級卵泡及生長卵泡，較多近成熟卵泡，黃體數(shù)多，黃體生長良好(圖3～5)。以中藥高劑量組最為明顯。

圖1 正常組HE染色圖(40×)

圖2 模型組HE(染色圖40×)

圖3 益經(jīng)湯高劑量組HE染色圖(40×)

圖4 益經(jīng)湯低劑量組HE(染色圖40×)

圖5 六味地黃丸組HE(染色圖40×)

3 討論

中醫(yī)學中雖無卵巢早衰病名，但古醫(yī)書籍有相似證散見于閉經(jīng)、血枯、年未老經(jīng)水斷、早發(fā)絕經(jīng)、不孕等證的記載之中。中醫(yī)學認為，月經(jīng)的產(chǎn)生和肝、脾、腎三臟密切相關(guān)。腎藏精，主生殖，為先天之本，所以腎臟對月經(jīng)的產(chǎn)生及生理活動起主導作用;肝腎同源，肝藏血，主升發(fā)、疏泄，條暢全身氣機，具有排泄月經(jīng)功能，對月經(jīng)有重要的調(diào)節(jié)作用;脾主運化，為氣血生化之源、后天之本，為月經(jīng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。而心通過胞脈與胞宮相通，且心氣下通于腎，心腎相交，血脈流暢，月事如常。若腎陰虧虛，水不涵木可致肝陽上亢，水不上濟心火則心腎不交;脾失健運，氣血生化乏源，心失所養(yǎng)。以上原因都會導致患者出現(xiàn)一系列軀體及精神心理癥狀。因此，現(xiàn)代醫(yī)家認為腎精虧乏、腎氣不足是其根本病機，而心肝脾功能失常與卵巢早衰發(fā)病密切相關(guān)。本虛標實、虛多實少是本病的病機特點。所以對于卵巢早衰基本治則應為益腎健脾，養(yǎng)心調(diào)肝，活血通經(jīng)。

益經(jīng)湯出自明末清初著名的醫(yī)學家傅山的醫(yī)著《傅青主女科》上卷調(diào)經(jīng)篇“年未老經(jīng)水斷”中，方劑由熟地黃、白術(shù)、山藥、當歸、白芍、生棗仁、牡丹皮、沙參、柴胡、杜仲、人參組成。傅山在益經(jīng)湯方后注明“此方心肝脾腎四經(jīng)同治藥也。妙在補以通之，散以開之……”，且云此方“連服八劑而經(jīng)通矣，服三十劑而經(jīng)不再閉，兼可受孕”?？梢姳痉骄哂辛己玫闹委熉殉苍缢サ呐R床功效。而現(xiàn)代臨床應用也證實，益經(jīng)湯對于繼發(fā)性閉經(jīng)、不孕癥、圍絕經(jīng)期綜合征都有著顯著的療效［2－4］。

本實驗結(jié)果表明，雷公藤可明顯損傷大鼠卵巢組織萎縮，使各級卵泡減少，尤其是成熟卵泡減少，因此雌激素分泌減少，故E2水平比較，模型組較空白組明顯降低，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，表明造模成功。而FSH各組間比較差異無統(tǒng)計學意義。益經(jīng)湯可使實驗性卵巢早衰大鼠降低的雌激素水平升高并接近正常水平，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且療效以益經(jīng)湯高劑量組為最好。說明益經(jīng)湯具有促進各級卵泡發(fā)育，尤其是促使優(yōu)勢卵泡成熟化從而促進顆粒細胞增殖，增加雌激素分泌，對卵巢早衰有較好的治療效果。

［1］傅山.傅青主女科［M］.上海:上?？茖W技術(shù)出版社，1991:27.

［2］宋永秀，解祥麗.益經(jīng)湯治療繼發(fā)性閉經(jīng)28例［J］.中國民間療法，2004，12(3):45 －46.

［3］張秀梅，和嵐.益經(jīng)湯加減治療虛性閉經(jīng)34例體會［J］.浙江中醫(yī)藥大學學報，2007，31(5):585 －587.

［4］張素香，陳燕妮.中西醫(yī)結(jié)合治療卵巢早衰［J］.實用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2010，10(1):38 －40.