正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選芪參口服液提取工藝

王建舫，崔 昊，高會(huì)軍，姜代勛，董 虹，穆 祥

（1．北京農(nóng)學(xué)院 獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 昌平 102206；2．石家莊華牧牧業(yè)有限責(zé)任公司獸藥分公司，河北 石家莊 050061）

芪參口服液是由傳統(tǒng)的中藥方劑四君子湯加減而來。方中黃芪益氣健脾為君藥；人參補(bǔ)中益氣為臣藥；白術(shù)苦溫，健脾燥濕為佐藥；甘草甘溫，益氣和中，調(diào)和諸藥為使藥。諸藥相合，共奏補(bǔ)中益氣、健脾胃之功效。前期的臨床研究證實(shí)，該制劑能夠增強(qiáng)雞的免疫能力。因此，為推動(dòng)芪參口服液的臨床應(yīng)用開發(fā)，本試驗(yàn)根據(jù)處方中藥材有效成分的理化性質(zhì)和藥理作用，選擇以干膏率和芪參口服液中主要藥效成分之一的黃芪甲苷提取量［1－6］為定量檢測(cè)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)藥物加水量、煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)加以考察，對(duì)芪參口服液的水提工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1．1 儀器 Waters2695高效液相色譜系統(tǒng)，Waters2424蒸發(fā)光檢測(cè)器，Empower工作站，日本YMC－Pack ODS－A色譜柱 （5μm，150mm×4．6 mm）。美國Millipore水純化系統(tǒng)，針筒式微孔濾膜過濾器（上海興亞凈化材料廠產(chǎn)品，孔徑0．45μm）。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，RE－3000A）。電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，DHG－9145A）。電子分析天平（Sartorius，CP423S）。

1．2 藥品與試劑 黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781－200613，購自中國藥品生物制品檢定所）；乙腈（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）。黃芪產(chǎn)自甘肅省，人參產(chǎn)自吉林省，白術(shù)產(chǎn)自河北省，甘草產(chǎn)自內(nèi)蒙古，以上4味藥材，均購自河北省安國市淤校中藥材棧。

1．3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1．3．1 因素水平的選擇 以加水量、煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)為考察因素，各取3個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。篩選最佳工藝條件，因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

1．3．2 樣品的制備 按處方量，稱取黃芪、人參、白術(shù)和甘草4味藥材，混合后浸泡1．0h，按照表2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案水煎提取，提取液混合后過濾、濃縮至1g／mL、放冷，置250mL玻璃瓶中備用。

1．4 干膏率的測(cè)定 精密量取工藝研究樣品20 mL，至蒸發(fā)皿蒸干，于105℃干燥至恒溫，稱重得干膏重（g），計(jì)算干膏得率。公式為：干膏率＝（干膏重／生藥材重量）×100%

1．5 黃芪甲苷含量的測(cè)定

1．5．1 色譜條件 色譜柱：YMC－Pack ODS－A 柱（5μm，150mm×4．6mm）；流動(dòng)相：乙腈∶水＝35∶65；流速：1．0mL／min。蒸發(fā)光檢測(cè)器：增益：1000；氮?dú)鈮毫Γ?0psi；噴霧器溫度：36℃；漂移管溫度：65℃。

1．5．2 溶液的制備 對(duì)照品溶液：精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品1．2mg，置10mL容量瓶中，定容至刻度，制成每毫升含1．2mg的黃芪甲苷對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

供試品溶液：精密量取本品20mL，用水飽和正丁醇振搖5次，每次25mL，合并正丁醇液；用氨試液振搖洗滌2次，每次20mL，合并正丁醇液；用蒸餾水洗滌2次，每次20mL，棄去水液；正丁醇液蒸干，殘?jiān)?mL甲醇使溶解作為供試品溶液。測(cè)定時(shí)過0．22μm微孔濾膜，取10μL進(jìn)樣。

陰性（缺黃芪）對(duì)照溶液：取缺黃芪的陰性樣品20mL，按供試品溶液制備項(xiàng)下的方法操作，得陰性對(duì)照溶液。

1．5．3 專屬性試驗(yàn) 按上述儀器和試驗(yàn)條件，吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀。

1．5．4 線性關(guān)系考察 精密吸取5、10、15、20、25、30、35μL對(duì)照品溶液注入色譜儀，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．5．5 精密度試驗(yàn) 取線性項(xiàng)下的同一份對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果精密度試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1．67%，精密度符合規(guī)定。

1．5．6 重復(fù)性試驗(yàn) 用同一批樣品溶液，重復(fù)配制6份供試品溶液，各取10μL注入色譜儀，結(jié)果6份供試品峰面積RSD為2．60%，重復(fù)性符合規(guī)定。

1．5．7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、6、8和10h進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果表明，供試品溶液10h內(nèi)峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2．03%，表明樣品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

1．5．8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的同一批樣品6份，按照供試品項(xiàng)下制備6份供試品溶液，分別精密加入5mL黃芪甲苷對(duì)照品溶液，取10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果6份樣品平均回收率為97．88%，RSD為3．20%，表明回收率良好。

1．5．9 樣品的測(cè)定 按供試品溶液制備項(xiàng)下方法分別制得9批工藝樣品溶液，按照上述色譜條件，測(cè)定黃芪甲苷的峰面積，用對(duì)數(shù)外標(biāo)法計(jì)算其含量。

2 結(jié)果

2．1 專屬性考查

吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果在黃芪甲苷對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性對(duì)照溶液在此保留時(shí)間處未見明顯的色譜峰，說明雜質(zhì)對(duì)本品黃芪甲苷含量測(cè)定無干擾，方法專屬性強(qiáng)（見色譜圖1～3）。

2．2 線性關(guān)系考察 經(jīng)對(duì)不同體積的黃芪甲苷對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定，得回歸方程為：y＝1．7327x＋3．7372，R2＝0．9989，r＝0．9994。結(jié)果表明，黃芪甲苷在0．60～6．00μg范圍內(nèi)，峰面積的對(duì)數(shù)值與黃芪甲苷進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值具有良好的線性關(guān)系。

2．3 干膏率的測(cè)定 精密量取工藝研究樣品20 mL，至蒸發(fā)皿蒸干，于105℃干燥至恒溫，稱重得干膏重（g），結(jié)果見表2。

圖4 黃芪甲苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2．4 黃芪甲苷含量的測(cè)定 9批工藝樣品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表2。

2．5 工藝的綜合評(píng)定 正交試驗(yàn)兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)干膏率和黃芪甲苷含量，采用綜合評(píng)分進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，干膏率和黃芪甲苷含量的權(quán)重系數(shù)均為0．5計(jì)。干膏得率評(píng)分＝（樣品干膏得率／最大干膏得率）×0．5×100；黃芪甲苷含量評(píng)分＝（樣品黃芪甲苷含量／最大黃芪甲苷含量）×0．5×100；綜合評(píng)分＝干膏得率評(píng)分＋黃芪甲苷含量評(píng)分（見表2）。

采用Microsoft Excel進(jìn)行分析，綜合直觀分析和方差分析判斷各因素對(duì)提取效果的影響程度，篩選出在該試驗(yàn)條件下的優(yōu)化提取參數(shù)（見表2）。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可知，以干膏率和黃芪甲苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各因素的影響順序?yàn)榧逯髸r(shí)間＞煎煮次數(shù)＞加水劑量，其中煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)對(duì)工藝有極顯著影響（見表3），因此煎煮時(shí)間為1h，煎煮次數(shù)為3。而對(duì)于無顯著影響的因素，只需結(jié)合具體工作及生產(chǎn)要求，本著盡量選擇平均數(shù)最大的水平，最終確定為煎煮時(shí)間1h，加水量10倍，煎煮3次。

表2 正交試驗(yàn)

表3 方差分析

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)芪參口服液中黃芪甲苷的提取條件進(jìn)行了考察，參考了《中國獸藥典》2005年版2部［1］黃芪甲苷含量測(cè)定項(xiàng)下提取方法，將樣品用水飽和正丁醇提取，分別用氨試液和蒸餾水洗滌，正丁醇蒸干后，比較了通過D101型大孔吸附樹脂柱除雜的處理方法和省略使用大孔吸附樹脂柱除雜的處理方法［7］。結(jié)果不經(jīng)D101型大孔吸附樹脂柱吸附洗脫的樣品在黃芪甲苷保留時(shí)間處無雜質(zhì)峰干擾，分離度好，而通過D101型大孔吸附樹脂柱吸附洗脫的樣品受試驗(yàn)操作影響較大，回收率較低。故本試驗(yàn)選用不經(jīng)大孔吸附樹脂柱除雜的處理方法。

目前，黃芪甲苷測(cè)定方法有薄層掃描法，但誤差較大。又由于皂苷為一類具有極性，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，它只在紫外末端有吸收，若采用紫外檢測(cè)末端吸收法（200～210nm）則有干擾峰，無法使用［5］。而蒸發(fā)光散射檢測(cè)器為質(zhì)量型檢測(cè)器，不受外部環(huán)境干擾，試劑在檢測(cè)器中全部蒸發(fā)，不干擾檢測(cè)，靈敏度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性均能符合含量測(cè)定的要求［6］。因此為提高芪參口服液工藝水平，可以采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定黃芪甲苷的含量。

本試驗(yàn)選取黃芪藥材有效成分黃芪甲苷的含量和干膏得率為優(yōu)選正交試驗(yàn)方案的指標(biāo)，采用高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定黃芪甲苷的含量，確定了芪參口服液中黃芪水提的最佳條件為煎煮時(shí)間1h，加水量10倍，煎煮3次。

［1］ 中國獸藥典委員會(huì)編．中華人民共和國獸藥典（二部）［S］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：312－313．

［2］ 高建，夏泉，黃建剛，等．HPLC－ELSD同時(shí)測(cè)定當(dāng)歸補(bǔ)血總苷中黃芪甲苷和黃芪皂苷II［J］．中成藥，2012，34（2）：268－272．

［3］ 王紅霞，王 蕾．HPLC－ELSD法測(cè)定利肝隆顆粒中黃芪甲苷的含量［J］．中國藥房，2011，22（44）：4208－4209．

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［5］ 易愛玲，周從輝，熊義濤．高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法測(cè)定補(bǔ)氣養(yǎng)血口服液中黃芪甲苷的含量［J］．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19（6）：1407－1408．

［6］ 王欣，郭宏偉，張愨，等．HPLC－ELSD法測(cè)定阿膠黃芪口服液中黃芪甲苷的含量［J］．現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，20（13）：1641－1642．

［7］ 謝委，方建國，杜光，等．高效液相色譜－蒸發(fā)光散射法測(cè)定扶正強(qiáng)筋片中黃芪甲苷含量［J］．醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31（2）：208－210．