羅非魚非腸道組織內(nèi)糞腸球菌的分離和鑒定

左 躍，易 弋，夏 杰，楊 軍，馮 丹，羅福廣，伍時華

（1．廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系，廣西 柳州545006；2．柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣西 柳州545006；3．國家羅非魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系柳州綜合試驗站，廣西 柳州545006）

近年來，羅非魚鏈球菌病給羅非魚產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。該病在我國南方地區(qū)5～10月份的高溫期容易流行，患病羅非魚眼球突出，眼眶出血，肛門腫大，在水中打轉(zhuǎn)游動，剖檢病魚，常見肝臟腫大，胃腸膨大等癥狀。且具有暴發(fā)速度快，波及范圍廣，死亡率高的特點［1－2］。羅非魚鏈球菌病的主要病原為無乳鏈球菌［3］和海豚鏈球菌［4］，其致病機理尚不明確。本試驗在患病羅非魚體的肝、腎、血液組織中分離鑒定出具有β溶血性的無乳鏈球菌的同時，分離出一株具有γ溶血性的菌株77γ。經(jīng)生理生化及分子鑒定，確定該菌株為糞腸球菌。由于糞腸球菌是魚類腸道內(nèi)的正常菌群，不會感染到非腸組織，我們認(rèn)為致病性的無乳鏈球菌可能破壞了羅非魚組織間的屏障，從而引起了糞腸球菌在羅非魚各組織間的轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1．1 試驗材料 發(fā)病羅非魚樣本采自廣西柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站羅非魚養(yǎng)殖基地；BHI培養(yǎng)基、鏈球菌細菌生化編碼鑒定試劑盒、革蘭陽性球菌藥敏試劑盒，購自杭州天和微生物試劑有限公司；血平板，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；預(yù)混DNA聚合酶，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；pMD18－T Vector，購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1．2 分離純化與培養(yǎng) 將患病羅非魚解剖，用燒紅的接種針插入到肝、腎以及血管內(nèi)，在組織內(nèi)輕微攪動5～10s后，于血平板劃線分離，30℃恒溫培養(yǎng)24 h。反復(fù)劃線分離直至純化。純化后的菌株在BHI培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)。

1．3 形態(tài)學(xué)觀察 取培養(yǎng)24h的菌體，經(jīng)革蘭染色后于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1．4 生理生化鑒定及藥敏試驗 采用鏈球菌細菌生化編碼鑒定試劑盒進行生理生化試驗，通過對應(yīng)的《鏈球菌生化編碼鑒定手冊》（GYZ－12St）進行鑒定。

按常規(guī)紙片法進行藥敏試驗，并按照說明書給出的標(biāo)準(zhǔn)判定菌株對藥物的敏感度。

1．5 16SrDNA序列分析 將純化后的細菌接種于BHI液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h。以菌液作為PCR模板，采用引物27F：（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和引物1492R：（5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′）擴增細菌的16SrDNA［5］。反應(yīng)體系（50μL）：2×EsTaqMaster Mix 25μL，模板2μL，引物（10μmol／L）各2μL，ddH2O 19μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1．0%瓊脂糖凝膠電泳進行膠回收，回收產(chǎn)物經(jīng)TA克隆后轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌感受態(tài)細胞中，涂布于含有50μg／mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)12h。所得陽性克隆，經(jīng)質(zhì)粒提取和PCR驗證后送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進行序列測定。將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析，采用MEGA5軟件將同源性相近的序列構(gòu)建進化樹。

1．6 無乳鏈球菌與糞腸球菌共培養(yǎng) 將無乳鏈球菌和糞腸球菌同時接種于BHI液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h后，將混合菌液稀釋至不同濃度梯度，取100 μL于血平板上涂布，30℃培養(yǎng)24h。利用2種細菌溶血性不同分別進行計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 菌株形態(tài) 從患病魚體的肝、腎和血液組織中均分離得到2種細菌，其中一種具有β溶血性，后鑒定為致病性無乳鏈球菌。另一種具有γ溶血性（分別命名為77γG、77γS和77γX），菌落為黃色，表面大而光滑，培養(yǎng)24h后直徑1～2mm，邊緣齊整。菌體革蘭染色呈陽性，為球形，直徑約0．5μm，單個或者成對排列（圖1）。

圖1 分離菌株的顯微形態(tài)

2．2 生理生化鑒定 將純化后的菌落分別接種于鏈球菌細菌生化編碼鑒定管，按說明書要求進行操作。結(jié)果顯示，菌株77γG、77γS和77γX的生理生化鑒定結(jié)果一致，如（表1）所示。參照《鏈球菌生化編碼鑒定手冊》（GYZ－12St）初步鑒定77γG、77γS和77γX均為糞腸球菌。

表1 菌株生理生化特性

基于上述鑒定結(jié)果，補做分離菌株在10℃，45℃以及6．5%氯化鈉條件下的生長試驗。結(jié)果表明，分離菌株在上述條件下均可以生長。這一試驗結(jié)果符合糞腸球菌的生長特性。

2．3 藥敏試驗 見表2。

表2 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果顯示，菌株77γG、77γS和77γX的藥敏性完全一致，均對苯唑西林等5種抗生素具有抗性（表2），表現(xiàn)出多重耐藥性。由于糞腸球菌細胞壁堅厚，對許多抗生素能表現(xiàn)出固有耐藥，同時也容易被誘導(dǎo)產(chǎn)生新的耐藥性［6］。近年來羅非魚鏈球菌病大面積暴發(fā)，養(yǎng)殖戶大量使用抗生素以降低養(yǎng)殖風(fēng)險。長期生長在含抗生素的環(huán)境中也可能是本文所分離的糞腸球菌具有多重耐藥性的原因之一。

2．4 16SrDNA序列分析 使用引物27F和1492R分別擴增菌株77γG、77γS和77γX的16SrDNA序列，均能得到1 500bp左右的特異性條帶。測序結(jié)果顯示，3株細菌的16SrDNA序列完全相同，由此可以確定3株細菌為同一種細菌，命名為77γ。BLAST顯示，菌株77γ的16SrDNA基因與糞腸球菌的16S rDNA基因具有高度同源性，進化樹分析表明，77γ與糞腸球菌具有最近的親緣關(guān)系（圖2）。

圖2 菌株77γ和相關(guān)菌種的系統(tǒng)進化樹

通過生理生化和分子鑒定，我們確定了從感染無乳鏈球菌的羅非魚肝、腎和血液組織中分離出的這株具γ溶血性的革蘭陽性球菌為糞腸球菌。

2．5 無乳鏈球菌與糞腸球菌共培養(yǎng) 按1．6的方法將無乳鏈球菌和糞腸球菌77γ進行共培養(yǎng)后計數(shù)，發(fā)現(xiàn)混合菌液中絕大多數(shù)是糞腸球菌，只有少部分是無乳鏈球菌，并測得培養(yǎng)基的pH值由初始的7．4下降到5．5。其原因可能為糞腸球菌在生長過程中產(chǎn)酸，降低了培養(yǎng)基的pH值，抑制了最適生長pH值為7．4～7．6的無乳鏈球菌的生長。

3 討論

近年來，羅非魚鏈球菌病大面積暴發(fā)，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大經(jīng)濟損失。該病的主要病原是無乳鏈球菌和海豚鏈球菌，在患病的同時，常常伴隨著其他致病菌的共同感染［7］。本試驗在患病羅非魚的非腸組織內(nèi)分離出致病性無乳鏈球菌的同時分離出了1株糞腸球菌，首次報道了糞腸球菌和無乳鏈球菌共同感染羅非魚的現(xiàn)象。

糞腸球菌是羅非魚腸道內(nèi)的正常菌群，可作為益生菌使用［8］，同時也有部分糞腸球菌是條件致病菌，能感染鴨［9］、羊［10］等動物致病。但糞腸球菌感染魚類致病的報道極少，因此很難斷定本文所分離的糞腸球菌77γ是否為羅非魚的致病菌。但根據(jù)77γ無溶血性這一特征，我們傾向于認(rèn)為77γ是羅非魚腸道中的正常微生物。

根據(jù)2．5的結(jié)果，糞腸球菌在生長過程中所產(chǎn)生的酸能抑制無乳鏈球菌的生長，推測無乳鏈球菌很難在糞腸球菌大量繁殖后的組織中再進行感染。糞腸球菌作為魚類腸道的正常菌群也很難在正常情況下突破組織間屏障感染到其他器官。而無乳鏈球菌作為一種特殊的致病菌，能夠破壞血腦屏障，感染到魚的大腦［11］。因此，我們推測糞腸球菌和無乳鏈球菌共同感染羅非魚的原因可能是無乳鏈球菌首先感染了羅非魚，并在各組織器官中繁殖，當(dāng)達到一定濃度后，引起鏈球菌疾病暴發(fā)。鏈球菌病暴發(fā)后，魚體各機能下降，再加上無乳鏈球菌的作用，破壞了組織間屏障（如腸黏膜屏障），使得腸道內(nèi)的糞腸球菌轉(zhuǎn)移到了其他非腸組織器官。

［1］ 盧邁新，黎炯，葉星，等．廣東與海南養(yǎng)殖羅非魚無乳鏈球菌的分離、鑒定與特性分析［J］．微生物學(xué)通報，2010，37（5）：766－774．

［2］ 鄧顯文，謝芝勛，謝志勤，等．廣西羅非魚海豚鏈球菌的分離鑒定［J］．廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41（005）：495－498．

［3］ 張新艷，樊海平，鐘全福，等．羅非魚無乳鏈球菌的分離、鑒定及致病性研究［J］．水產(chǎn)學(xué)報，2008，32（05）：118－125．

［4］ Weinstein M R，Litt M，Kertesz D A，etal．Invasive infections due to a fish pathogen，Streptococcusiniae［J］．New England Journal of Medicine，1997，337（9）：589－594．

［5］ Hongoh Y，Yuzawa H，Ohkuma M，etal．Evaluation of primers and PCR conditions for the analysis of 16SrRNA genes from a natural environment［J］．FEMS microbiology letters，2003，221（2）：299－304．

［6］ Huycke M M，Sahm D F，Gilmore M S．Multiple－drug resistant enterococci：the nature of the problem and an agenda for the future［J］．Emerging infectious diseases，1998，4（2）：239－249．

［7］ 汪開毓，陳德芳，黃凌遠．羅非魚無乳鏈球菌病診治［J］．海洋與漁業(yè)：水產(chǎn)前沿，2011（8）：55－58．

［8］ 韓繼宏，吳桂時，韓波．糞鏈球菌在飼料中的應(yīng)用［J］．漁業(yè)致富指南，2005（021）：20－21．

［9］ 陳一資，蔣文燦，胡濱．對鴨場暴發(fā)罕見的糞鏈球菌病的研究［J］．中國獸醫(yī)學(xué)報，2003，23（4）：324－325．

［10］齊亞銀，剡根強，王靜梅，等．致羔羊腦炎型糞腸球菌的分離及鑒定［J］．石河子大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，23（2）：200－202．

［11］Evans J J，Klesius P H，Pasnik D J，etal．Human Streptococcus agalactiae isolate in Nile tilapia （Oreochromis niloticus）［J］．Emerging infectious diseases，2009，15（5）：774－776．