抗柔嫩艾美耳球蟲ScFv－PE40重組毒素的活性測定

郝景鋒，吳 斌，蔡華東，趙 權(quán)

（1．吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 吉林 132101；2．吉林省磐石市園藝特產(chǎn)技術(shù)推廣站，吉林 磐石 132300；3．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生院，吉林 長春 130118）

作為雞球蟲病主要的病原體之一，柔嫩艾美耳球蟲（E．tenella）對雛雞的危害非常嚴(yán)重，針對柔嫩艾美球蟲病，目前主要依靠藥物防治和疫苗免疫。由于藥物防治存在耐藥性和藥物殘留問題，效果不太理想；同時，活苗免疫不但具有潛在的致病力，而且生產(chǎn)成本較高，免疫程序復(fù)雜，特別是免疫后的監(jiān)測和管理技術(shù)要求較高，不能得到廣泛應(yīng)用［1］。這就需要找到其他更為安全、簡單、廉價、有效的防治措施。近些年來，多種球蟲保護(hù)性抗原基因被克隆表達(dá)，在已經(jīng)報道E．tenella基因中，ScFv基因編碼的抗原位于子孢子折光體上，在球蟲孢子生殖階段過渡到裂殖生殖階段發(fā)揮很重要的生物學(xué)功能，其基因表達(dá)產(chǎn)物具有一定的免疫保護(hù)作用，而且對其他球蟲具有一定的交叉保護(hù)［2］。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)研制基因工程疫苗已成為當(dāng)前防治球蟲病較為理想的選擇。

本實驗室已經(jīng)對E．tenella子孢子表面抗原ScFv基因進(jìn)行了克隆和序列測定，將目的基因連接pET28a（＋）載體進(jìn)行原核表達(dá)后，對海藍(lán)小公雛感染柔嫩艾美耳球蟲的保護(hù)效果進(jìn)行觀察評價，為進(jìn)一步在臨床上控制雞球蟲病提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 重組免疫毒素（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲實驗室饋贈）：本試驗構(gòu)建重組毒素時使用的是pET28a（＋）表達(dá)載體，因其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物N末端包含His－Tag，所以能夠采用金屬Ni2＋親和層析柱方法純化該目的蛋白。試驗動物：1日齡海藍(lán)小公雛，購自長春市北方養(yǎng)雞場。E．tenella蟲株，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲實驗室保存。

1．2 方法

1．2．1 試驗分組 設(shè)立陰性對照（非感染非免疫對照組）為第1組，陽性對照（感染非免疫對照組）為第2組，試驗組即重組免疫毒素組為第3組。

1．2．2 試驗設(shè)計 試驗動物選取1日齡的球蟲檢測陰性海藍(lán)公雛雞，飼養(yǎng)至12日齡隨機(jī)分成3組，每組20羽，自由飲水采食，首免于14日齡，100μg／羽，胸部肌肉注射，采用同樣劑量于21日齡加強免疫，于28日齡先稱重，每羽口服1×105個易感染的E．tenella孢子化卵囊，逐日觀察記錄精神狀態(tài)以及死亡數(shù)量，36日齡宰殺，逐只稱重、盲腸病變計分以及卵囊計數(shù)，計算ACI，應(yīng)用SPSS 13．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1．2．3 抗球蟲效果的判定

1．2．3．1 盲腸病變值與判定指標(biāo) 36日齡試驗雞先稱重，宰殺，按Johnson方法判定盲腸病變記分，標(biāo)準(zhǔn)如下：剖檢未見任何病變記為0分；盲腸壁出現(xiàn)極少數(shù)出血點且內(nèi)容物正常記作＋1；盲腸出血，腸壁肥厚，有出血點記作＋2；盲腸出現(xiàn)栓塞，大量出血，腸壁萎縮或者變形記作＋3；盲腸內(nèi)出現(xiàn)栓芯或者凝血塊，盲腸萎縮嚴(yán)重，腸壁增厚記作＋4。若兩側(cè)病變程度不相同時，按照病變較嚴(yán)重側(cè)計算［3］。

病變值＝各組平均病變記分×10

1．2．3．2 OPG值測定 從感染后第5天開始，每天收集1～5組的糞便至攻蟲后第9天。采用司陶爾蟲卵記數(shù)法測定OPG值［4］。

表1 克盲腸內(nèi)容物卵囊值換算標(biāo)準(zhǔn)

1．2．3．3 增重 本次增重指標(biāo)的測定范圍是20～36日齡，計算公式如下：平均增重＝撲殺時平均體重一攻蟲前平均體重；平均增重率＝平均增重／攻蟲前平均體重

相對增重率（%）＝平均增重率／陰性對照組平均增重率×100%

1．2．3．4 抗球蟲指數(shù)（ACI） 根據(jù)如下公式計算：ACI＝（相對增重率＋存活率）－（病變值＋卵囊值）

ACI＞180時即為保護(hù)效果明顯；ACI為160～179時即為保護(hù)效果較好；ACI為160～120時即為保護(hù)效果一般；ACI＜120時即為無保護(hù)效果［5］。

2 試驗結(jié)果

2．1 臨床癥狀觀察結(jié)果 21日齡后第3組雞未出現(xiàn)明顯異常狀況，各雞只精神狀態(tài)良好。攻蟲后第5天，第2、3組試驗雞只陸續(xù)出現(xiàn)精神沉郁，食欲減退，第2組雞糞便出血嚴(yán)重，第3組糞便少量出血。各試驗組分別用飽和食鹽水漂浮法進(jìn)行卵囊計數(shù)，結(jié)果顯示已有卵囊生成。第2，3組雞于感染后第6～9天均檢出卵囊，第2組卵囊數(shù)量較高。期間第1組雞未出現(xiàn)任何異常，糞檢時無卵囊出現(xiàn)。

2．2 雞只增重變化 從表2可以看出，使用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，攻蟲前，各試驗分組差異均不顯著（P＞0．05），表明疫苗免疫對增重基本未產(chǎn)生影響。宰殺之前，第3組試驗雞體重增重明顯高于陽性對照組，差異顯著（P＜0．05），說明融合蛋白對E．tenella感染具有一定的抵抗作用。第3組與第1組體重差異顯著（P＜0．05），說明試驗組對E．tenella感染不能完全保護(hù)。

2．3 盲腸病變計分 盲腸病變計分統(tǒng)計情況如表3所示。由表3可看出各試驗組與陰性對照組的差異均顯著，第3組與第2組差異顯著，第3組的盲腸病變記分最小，為1．8，抗球蟲效果較好。

2．4 OPG值測定結(jié)果 33～36日齡各組雞的糞便卵囊計數(shù)（OPG）值測定結(jié)果見表4，由表4可以看出，試驗各組與陰性對照組比較差異均顯著，并且與陽性對照組差異顯著。其中第3組的OPG值最小為15 000，卵囊數(shù)量下降率最大，為40．78%。2．5 重組蛋白免疫對球蟲感染的綜合保護(hù)效果從表4可以看出，各組的ACI值，重組免疫毒素組較高，對雞體具有較好的保護(hù)效果。

表2 重組蛋白免疫對球蟲感染的增重效果的影響

表3 盲腸病變記分

表4 感染后5～9d各組雛雞的OPG值

表5 重組蛋白免疫對球蟲感染的保護(hù)效果

3 討論

雞球蟲病是雞常見且危害十分嚴(yán)重的寄生蟲病，是由一種或多種球蟲引起的急性流行性寄生蟲病。雛雞感染球蟲后，主要癥狀可見大量腸上皮細(xì)胞受損、出血，嚴(yán)重者造成死亡，病愈雞長期不能康復(fù)，生長及生產(chǎn)性能都受到嚴(yán)重影響。它造成的經(jīng)濟(jì)損失是驚人的，是嚴(yán)重威脅著封閉式工廠化養(yǎng)雞發(fā)展的一種重要的疾病。近年來，多種球蟲保護(hù)性抗原基因被克隆表達(dá)，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)基因工程疫苗用于預(yù)防雞球蟲病越來越得到人們的重視。通過肌肉、鼻腔、靜脈、真皮、皮下及腹腔等不同接種途徑進(jìn)行免疫，免疫效果表明，肌肉注射和靜脈注射效果最好。

本研究采用肌肉注射的方法是對14日齡雛雞進(jìn)行首次胸腺部位免疫，21日齡進(jìn)行加強免疫。在28日齡稱重后經(jīng)口服感染1×105個E．tenella孢子化卵囊。36日齡宰殺所有雞只，根據(jù)雞只體內(nèi)注射重組免疫毒素免疫后的盲腸病變記分、OPG、增重、結(jié)合抗球蟲指數(shù)（ACI）等相關(guān)抗球蟲感染指標(biāo)檢測，試驗表明，重組蛋白可以顯著減少盲腸病變記分和卵囊排出，抑制增重減少，相對增重率和卵囊減少率是評價雞球蟲疫苗免疫保護(hù)效果的兩個重要的指標(biāo)。不論應(yīng)用藥物處理還是使用疫苗進(jìn)行免疫后，其目的都是削減蟲卵卵囊的生成，使環(huán)境中的卵囊控制在非致病水平，因此目前以卵囊減少率作為

在雞球蟲病的免疫研究中評價保護(hù)效果的基本指標(biāo)。結(jié)果顯示，免疫毒素組的卵囊減少率達(dá)到40．78%，而相對增重率明顯要比陽性對照組高。但免疫效果并不十分理想，飼養(yǎng)方式可能是一方面原因，地面平養(yǎng)雞的生活條件會使墊料變濕，卵囊孢子化容易再次被雞采食，造成再次感染；免疫間隔時間過短可能是另一方面原因，有研究成果表明，DNA疫苗必須進(jìn)行多次加強免疫，但每次加強免疫間的間隔時間要相對較長［6］，Klotz等（2007）認(rèn)為要獲得理想的保護(hù)效果間隔時間最好能達(dá)到3～4周［7］。綜合表明，重組免疫毒素對可誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生一定的抗球蟲感染的免疫保護(hù)力。

［1］ ChaPman H D，Cherry T E，Danforth H D，Richards G，Shirley M W，Williams R B．Sustainable coccidiosis control in poultry production：the role of lives vaccines．Int J Parasitol，2002，32（5）：617－629．

［2］ 彭金彪．雞柔嫩艾美耳球蟲重組SO7抗原的免疫保護(hù)作用［D］．揚州：揚州大學(xué)，2007：5：64－65．

［3］ 王卉．雞柔嫩艾美耳球蟲楊凌株SO7和TA4抗原基因的克隆與表達(dá)及免疫保護(hù)性試驗［D］．楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2009：5：47－48．

［4］ 李安興，蔣金書．柔嫩艾美耳球蟲（Eimeriatenella）BJ株S07重組抗原的免疫試驗［J］．中國獸醫(yī)學(xué)報，2000，20（2）：167－170．

［5］ 彭維剛．雞柔嫩艾美耳球蟲楊凌株RB1－a基因的克隆表達(dá)與免疫保護(hù)性試驗［D］．楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011，5：35．

［6］ 許金俊，陶建平，彭金彪，等．不同佐劑和免疫途徑對柔嫩艾美耳球蟲SO7抗原免疫保護(hù)效果的影響［J］．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2007，29（9）：702－703．

［7］ Klotz C，Gehre F，Lucius R，Pogonka T．Identification of Eimeria tenella genes encoding for secretory proteins and evaluation of candidates by DNA immunization studies in chickens［J］．Vaccine，2007，25（36）：6625－6634．