EMA－PCR檢測金黃色葡萄球菌活菌的方法

趙素君，李江凌，謝 晶，曹 冶，王秋實，葉勇剛，羅丹丹，葉健強，廖黨金

（四川省畜牧科學研究院，四川 成都610066）

金黃色葡萄球菌（SA）是一種重要的人畜共患病病原，是引起細菌性食物中毒以及人和動物感染的重要病原菌之一。目前，細菌分離培養(yǎng)仍是金黃色葡萄球菌檢測的常規(guī)方法，該法雖然可靠，但耗時、費力不能滿足快速檢測的需要；而免疫學方法對各種致病因子的檢測，因毒素因子血清型復雜且同源性高，在檢測過程中難免出現血清型之間的交叉反應，導致假陽性，同時因檢測靈敏度低導致出現假陰性?？傊捎脗鹘y的方法對該菌的檢測存在很大的局限。PCR技術以靈敏度高、特異性強、簡便和快速等優(yōu)點被越來越多地應用于金黃色葡萄球菌的檢測中。

金黃色葡萄球菌能產生多種毒素和酶，其中由nuc基因編碼的耐熱核酸酶（Thermostable Nuclease，TNase），是一種侵襲性酶，能迅速分解核酸，利于病菌的擴散。nuc基因不僅為金黃色葡萄球菌所特有，而且在不同菌株之間具有較高的保守性，因此，很多研究采用了nuc基因作為擴增的靶基因［1－4］。

傳統PCR技術無法區(qū)分樣品中的死菌與活菌，雖然死菌已經沒有危害性，但其DNA長期存在，死菌DNA在PCR檢測中也能擴增出目的基因，從而使檢測結果出現大量的假陽性，干擾了檢測的真實性。疊氮溴乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA）是一種熒光插入型的核酸結合染料，能穿過死細菌的細胞膜，在光激活的作用下與基因組DNA共價結合，從而能抑制樣品中死菌體的DNA進行PCR擴增；而完整未受損傷的活菌細胞膜能阻止EMA滲透，對活菌DNA不起作用［5－6］。本試驗將EMA與PCR技術結合，通過特異性擴增耐熱核酸酶編碼基因nuc基因，建立一種快速、有效的檢測金黃色葡萄球菌活菌的方法。由于在檢測過程中除去了死細胞DNA對PCR的干擾，從而大大提高了檢測的準確性和真實性，為金黃色葡萄球菌病原檢測提出了一個全新的手段。

1 材料與方法

1．1 菌株 陽性菌株：金黃色葡萄球菌CVCC3055、CVCC3056；對照菌株：腸毒性大腸桿菌CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、CVCC215，腸出血性大腸桿菌CVCC248，腸侵襲性大腸桿菌CVCC2072，腸致病性大腸桿菌CVCC251，沙門菌CVCC504，均購自中國獸醫(yī)藥品檢查所中國獸醫(yī)微生物菌種保存管理中心。

1．2 主要試劑 EMA為Biotium公司產品；TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL－2 000DNA Marker，購自TaKaRa公司；其他化學試劑均為國產分析純；引物合成及核酸測序由Invitrogen公司完成。

1．3 引物設計與合成 根據GenBank中金黃色葡萄球菌nuc基因序列設計引物如下，F：5′－TTAGCCAAGCCTTGACGAAC－3′；R：5′－AGGGCAATACGCAAAGAGGT－3′，擴增目的片段長度為480bp。

1．4 金黃色葡萄球菌活菌和死菌的制備 接種金黃色葡萄球菌CVCC3055，培養(yǎng)16h后，取1mL菌液于EP管中，6 000r／min（4℃）離心5min，收集菌體沉淀，加入無菌生理鹽水重懸沉淀，制成活菌懸液。再將活菌懸液72℃水浴15min，得到死菌懸液。

1．5 EMA處理 取適量菌懸液于EP管中，加入終濃度為100g／mL的EMA，在黑暗處放置5min后，于650W鹵素光源光照處理1min，光源放在離樣品管20cm處，光照時EP管放在冰上，以免樣品溫度過高。EMA處理后的樣品，用于下面的DNA模板的制備。

1．6 模版DNA的制備 取1mL菌液，12 000r／min離心5min，去除上清液，然后用100μL滅菌去離子水重懸，然后100℃水浴5min后，再10 000r／min離心5min，上清液用作PCR檢測。

1．7 PCR反應體系及反應條件優(yōu)化 PCR反應體系：10×ExTaqBuffer（含 MgCl2）2．5μL，dNTP mixture（各2．5mmol／L）2μL，引物（20μmol／L）各0．5μL，模板 DNA 1μL，TaKaRa ExTaq（5U／L）0．2L，滅菌雙蒸水加至25μL。

PCR反應條件優(yōu)化主要通過退火溫度來實現，為了獲得特異性的擴增片段，采用Touchdown PCR方法確定PCR反應合適的退火溫度，設定退火溫度范圍65℃～45℃。擴增結果經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．8 PCR特異性檢測 以CVCC3055、CVCC3056作為陽性菌株；以 CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、 CVCC215、 CVCC248、 CVCC2072、CVCC251、CVCC504作為陰性對照，進行PCR擴增，結果經瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠成像系統進行觀察，出現特異性擴增條帶，即為檢測陽性，否則為陰性。

1．9 PCR靈敏度檢測 接種金黃色葡萄球菌CVCC3055，培養(yǎng)16h，取1mL菌液于EP管中，遞倍稀釋10－1～10－9，進行如上模板DNA制備，PCR檢測其靈敏度。同時，采用平板法進行細菌計數，通過牛肉膏蛋白胨瓊脂平板進行對照計數。分別取遞倍稀釋100～10－9的菌液50μL進行涂板，37℃過夜培養(yǎng)，然后分別進行計數，計算檢測靈敏度。

1．10 不同活細菌比例的混合菌懸液的EMA－PCR擴增 分別配制含有100%、75%、50%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0%的金黃色葡萄球菌CVCC3055活細菌菌懸液混合體系，分別加入終濃度為100μg／mL的EMA，在黑暗處放置5min后，樣品置于冰上用650W鹵素光源距離20cm處光照處理1 min，經EMA處理后的菌液，用于如上DNA模版的制備，進行PCR擴增。

2 結果

2．1 PCR反應條件的優(yōu)化 經過Touchdown PCR方法確定最佳的PCR反應條件為：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃45s，28個循環(huán)；72℃延伸5min。

2．2 金黃色葡萄球菌nuc基因的PCR特異性檢測結果 PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示（見圖1），只有金黃色葡萄球菌CVCC3055和CVCC3056擴增出480bp的目的條帶，DNA測序結果經BLAST分析，與GenBank上序列完全一致。而對照菌株 CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、CVCC215、 CVCC248、 CVCC2072、 CVCC251、CVCC504均未檢測到特異性條帶，結果為陰性。

2．3 金黃色葡萄球菌nuc基因的PCR檢測靈敏度分析 將各梯度稀釋液100～10－9分別進行nuc基因的PCR擴增，結果經瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖2所示，其靈敏度檢測低限為10－9，而相應的平板計數為15CFU／mL。

圖2 PCR檢測的靈敏性試驗

2．4 金黃色葡萄球菌EMA－PCR區(qū)分死菌與活菌的檢測結果 EMA－PCR擴增結果經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示，除了全部是死菌的組外，其他含活菌各種比例的混合菌液中，均出現特異性擴增條帶，見圖3。

圖3 EMA－PCR對金黃色葡萄球菌活菌／死菌混合物的檢測

3 討論

金黃色葡萄球菌能產生多種毒素，主要有腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）、剝脫毒素（ETs）和中毒休克毒素（TSST－1）等［7］。由于金黃色葡萄球菌的致病性主要與各種毒素有關，因此對各種毒素基因的檢測一直以來都是研究的熱點。目前，雖然金黃色葡萄球菌各種毒素的基因都已克隆并測序，人們可以根據各種毒素基因的保守和特異序列，設PCR引物，從而對金黃色葡萄球菌各種毒素直接進行PCR檢測，但不同菌株包含不同毒素基因，同一菌株也可包含多種腸毒素基因［8］，因其血清型復雜多樣在實際樣品的檢測中仍存在一定的局限性。從而選擇特異的靶基因在SA的PCR檢測中至關重要。本試驗選用由nuc基因編碼的耐熱核酸酶，作為鑒定金黃色葡萄球菌的重要指標。耐熱核酸酶是金黃色葡萄球菌產生的一種細胞外酶，能迅速分解核酸，利于病原菌的擴散。nuc基因作為擴增的靶基因具有較高的種屬特異性和保守性。

SA的檢測方法主要有分離培養(yǎng)法、瓊脂擴散法、免疫學檢測法、血清學及核酸探針檢測法，這些方法即費時費力，又易出現假陽性和假陰性，很難滿足快速檢測需要。PCR技術快速敏感、操作簡便，成為近年來病原菌鑒定研究的熱點。但在檢測中傳統PCR技術無法區(qū)分樣品中的死菌與活菌，死菌DNA在PCR檢測中也能擴增出目的基因，從而使檢測結果出現大量的假陽性。本試驗采用EMA－PCR技術，利用EMA能穿過死菌的細胞膜并在光激活的作用下能與基因組DNA共價結合，從而能抑制死菌DNA進行PCR擴增的特性，通過特異性擴增nuc基因，建立了一種快速、有效的檢測金黃色葡萄球菌活菌的方法。由于在檢測過程中通過EMA選擇性的與混合細菌菌落中的死菌DNA共價結合，除去死菌DNA的PCR干擾，從而使檢測結果準確、可靠，對金黃色葡萄球菌的檢測具有較好的應用價值，在臨床檢測上具有重要的意義。

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［3］ Pinto B，Chenoll E，Aznar R．Identification and typing of foodborne Staphylococcus aureus by PCR－based techniques［J］．Syst Appl Microbiol，2005，28：340－352．

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［5］ Lee J L，Levin R E．A comparative study of the ability of EMA and PMA to distinguish viable from heat killed mixed bacterial flora from fish fillets［J］．J Microbiol Methods，2009a，76：93－96．

［6］ Lee J L，Levin R E．Discrimination of viable and dead Vibrio vulnificus after refrigerated and frozen storage using EMA，sodium deoxycholate and real－time PCR［J］．J Microbiol Methods，2009b，79：184－188．

［7］ 傅丹青，陳棋炯，丁水軍，等．金黃色葡萄球菌腸毒素基因的檢測與分型［J］．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，21（5）：1167－1169．

［8］ 張鳳笑，石磊．PCR技術在金黃色葡萄球菌中的研究進展［J］．現代食品科技，2008，24（10）：1042－1047．