大慶油田聚驅(qū)后油藏細(xì)菌群落演替規(guī)律研究

張 虹,任國領(lǐng),曲麗娜,丁海燕,張 瑩,黃永紅

(大慶師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 黑龍江 大慶 163712)

0 引言

聚合物驅(qū)油技術(shù)對大慶油田提高原油采收率起到了極其重要的作用[1]。但是，聚驅(qū)后油藏如何提高原油采收率已經(jīng)成為困擾大慶油田發(fā)展的問題之一。耗資少、能源消耗少、投入產(chǎn)出高、直接利用微生物菌種和對環(huán)境無污染的微生物采油技術(shù)(Microbial enhanced oil recovery, MEOR) 已成為石油開采技術(shù)的研究熱點(diǎn)。目前，微生物采油技術(shù)在大慶油田已經(jīng)進(jìn)入礦場實(shí)驗(yàn)階段，但該技術(shù)仍存在一些關(guān)鍵性問題尚未解決，即對微生物采油過程中菌群結(jié)構(gòu)演替規(guī)律分析不夠[2]。基于16S rDNA基因的微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，研究油藏環(huán)境中的微生物突破傳統(tǒng)培養(yǎng)方法認(rèn)知和研究微生物的局限性，應(yīng)用微生物分子生態(tài)學(xué)方法研究油藏微生物群落結(jié)構(gòu)的報(bào)道也日益增多[3]。Huang等[4]利用構(gòu)建16S rDNA克隆文庫的方法，研究大慶油田低滲透油藏微生物群落結(jié)構(gòu)和種群多樣性；Orphan V J等[5]建立16S rDNA 克隆文庫與富集培養(yǎng)相結(jié)合的方法，研究加利福尼亞某高溫油藏中微生物的多樣性；She YH等[6]利用PCR-DGGE技術(shù)分析了新疆克拉瑪依油田一中區(qū)原油儲層微生物群落結(jié)構(gòu)及種群多樣性。

采用PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分析大慶油田聚驅(qū)后油藏北-2-4-P49油井微生物調(diào)剖不同時(shí)期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢種群變化規(guī)律，以及主要的采油功能菌，為大慶油田聚驅(qū)后油藏微生物采油技術(shù)現(xiàn)場試驗(yàn)提供基礎(chǔ)資料和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 樣品來源和油藏特征

北-2-4-P49油井位于大慶油田北二西西塊聚合物驅(qū)后區(qū)塊，砂巖厚度、有效厚度、地層系數(shù)、靜壓分別為24.6m、15.7m、15.57、12.13 MPa。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集及微生物群落基因組總DNA的提取

樣品采集和基因組DNA的提取按文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，基因組儲存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR-DGGE

PCR擴(kuò)增：從油藏微生物基因組DNA擴(kuò)增用于DGGE的16S rDNA引物為大多數(shù)細(xì)菌16S rDNA通用引物為BSF338/BSR534[8]，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長約為200 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系[9]: 1.5 μL 模板，12.5 μL Premix Taq VERSION，0.75 μL 正向引物(25 mmol/L)，0.75 μL反向引物 (25 mmol/μL)和適量超純水(補(bǔ)足25 μL)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃，預(yù)變性5 min，循環(huán)過程為：94 ℃,1 min ,30 s；54 ℃,1 min,30 s；72 ℃,45 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用TaKaRa凝膠回收和純化試劑盒進(jìn)行回收和純化。

DGGE分析：DGGE電泳按照Bio-Rad基因突變檢測儀說明進(jìn)行。電泳后對目的片段進(jìn)行銀染、切膠和回收，連接到pMD-19T載體進(jìn)行克隆子16S rDNA序列測序，測序由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)公司完成。尋找最相似的已知序列及最相似的已知分類地位的序列方法按文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。用MEGA4對歸為同一OUT的16S rDNA基因序列及它們在GenBank中的最相似序列構(gòu)建鄰接進(jìn)化樹(Neighbor-joining tree)[10]，進(jìn)行進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因組的提取和16S rDNA的擴(kuò)增

首先，提取微生物調(diào)剖前、中、后時(shí)期樣品的細(xì)菌基因組，如圖1A所示，得到的基因組條帶清晰，明亮，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。然后，用大多數(shù)細(xì)菌16S rDNA 通用引物BSF338/BSR534擴(kuò)增用于PCR-DGGE的16S rDNA基因，如圖1B所示，我們得到的16S rDNA 基因PCR產(chǎn)物條帶清晰、特異性高。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖回收和純化試劑盒進(jìn)行回收和純化。

圖1 基因組的提取和16S rDNA的擴(kuò)增 A) 細(xì)菌基因組, B) 16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增1、2、3分別代表微生物調(diào)剖前、中、后期

2.2 DGGE電泳和分析

2.2.1 DGGE電泳

16S rDNA擴(kuò)增后，對微生物調(diào)剖前、中、后期的細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳。如圖2所示，微生物調(diào)剖不同時(shí)期，優(yōu)勢條帶明顯，并且，優(yōu)勢條帶有一些明顯的變化。微生物調(diào)剖過程中，p7、p10、p20條帶有明顯增強(qiáng)趨勢。這些結(jié)果初步表明，北-2-4-P49油井在微生物調(diào)剖過程中細(xì)菌多樣性豐富，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化明顯。

圖2 細(xì)菌16S rDNA V3～V6 區(qū)PCR-DGGE 圖譜, 1、2、3分別代表微生物調(diào)剖前、中、后期

2.2.2 DGGE分析

對優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠、克隆，克隆子測序結(jié)果經(jīng)過拼接處理后，以FASTA格式在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析(見表1)，并對它們及其在GenBank中的最相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，微生物調(diào)剖早期優(yōu)勢細(xì)菌菌群主要包括假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)和一些未培養(yǎng)細(xì)菌；微生物調(diào)剖中期優(yōu)勢細(xì)菌菌屬主要包括不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、厚壁菌屬(Firmicutes bacterium)、和一些未培養(yǎng)細(xì)菌；微生物調(diào)剖后期優(yōu)勢細(xì)菌菌屬主要包括不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、厚壁菌屬(Firmicutes bacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)和一些未培養(yǎng)細(xì)菌。微生物調(diào)剖過程中，有明顯增強(qiáng)趨勢條帶p7、p10、p20分別代表的是厚壁菌屬(Firmicutes bacterium)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)。這一結(jié)果與Ren GL[4]在大慶油田的研究結(jié)果以及國內(nèi)其它油田[11-13]的研究結(jié)果較一致。結(jié)果顯示，作為主要微生物采油菌它們在大慶油田微生物調(diào)剖過程中可以起到降解烷烴、降解聚丙烯酰胺、脫硫、脫氮和產(chǎn)生表面活性劑降低稠油黏度的作用[14-15]。

3 結(jié)語

應(yīng)用分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，研究了大慶油田聚驅(qū)后油藏北-2-4-P49油井微生物調(diào)剖過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律。細(xì)菌微生物基因組大小約為23kp，用于DGGE的16S rDNA的PCR擴(kuò)增條帶大小約為200bp，DGGE實(shí)驗(yàn)條帶豐富、清晰、易于后續(xù)操作。

微生物調(diào)剖過程中，細(xì)菌微生物多樣性豐富，優(yōu)勢條帶明顯，優(yōu)勢細(xì)菌菌群變化較大。早期優(yōu)勢細(xì)菌菌群主要是假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)和一些未培養(yǎng)細(xì)菌；中期優(yōu)勢細(xì)菌菌屬主要是不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、厚壁菌屬(Firmicutes bacterium)和一些未培養(yǎng)細(xì)菌；后期優(yōu)勢細(xì)菌菌屬主要是不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、厚壁菌屬(Firmicutes bacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)和一些未培養(yǎng)細(xì)菌。微生物調(diào)剖過程中，厚壁菌屬(Firmicutes bacterium)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)有明顯增加的趨勢。

對微生物調(diào)剖過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律的研究可以為微生物采油過程提供技術(shù)指導(dǎo)和實(shí)際參考。

表1 微生物調(diào)剖過程細(xì)菌16S rDNA的PCR-DGGE優(yōu)勢種群分析

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王德民, 程杰成, 吳軍政, 等. 聚合物驅(qū)油技術(shù)在大慶油田的應(yīng)用[J]. 石油學(xué)報(bào), 2005,26(1):74-78.

[2] Ren H Y, Zhang X J, Song Z Y, et al. Comparison of Microbial Community Compositions of Injection and Production Well Samples in a Long-Term Water-Flooded Petroleum Reservoir[J]. PLoS One, 2011, 6(8): e23258.

[3] Wang W D. Microbial Diversity of Guantao-3 Member of Zhongyi Block, Gudao Oil Field in China[J]. Chin J Appl Environ Biol, 2010, 16 (3): 415-419.

[4] 黃永紅,袁紅梅,伍曉林,等. 大慶油田低滲透油藏微生物群落結(jié)構(gòu)解析[J]. 大慶石油學(xué)院學(xué)報(bào),2009,33(4):63-66.

[5] Orphan V J, Taylor LT, Hafenbradl D, et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microbial assemblages associated with high-temperature petroleum reservoirs[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(2):700-711.

[6] 佘躍惠, 張凡, 向廷生, 等. PCR-DGGE方法分析原油儲層微生物群落結(jié)構(gòu)及種群多樣性[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2005, 25(2):237-242.

[7] 任國領(lǐng), 袁紅梅, 侯兆偉, 等. 大慶油田油藏微生物基因組DNA提取及分析[J]. 東北石油大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 34(4):89-93.

[8] Huang YH, Ren GL, Wei L, et al. Analysis of microbial community succession in Daqing oil field[J]. Advanced Materials Research, 2010, 113-114: 830-834.

[9] 江云飛, 蔡柏巖. PCR-DGGE技術(shù)在細(xì)菌多樣性研究中的條件優(yōu)化[J]. 生物技術(shù), 2009, 19(5): 84-87.

[10] Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, et al. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Res, 1997, 25(24):4876-4882.

[11] 佘躍惠, 張學(xué)禮, 張 凡, 等. 大港孔店油田水驅(qū)油藏微生物群落的分子分析[J].微生物學(xué)報(bào),2005,45(3):329-334.

[12] 袁三青, 薛燕芬, 汪衛(wèi)東, 等. 勝利油田單12高溫油藏非培養(yǎng)和富集培養(yǎng)樣品的細(xì)菌組成特性[J].微生物學(xué)報(bào),2008,48(8): 1082-1087.

[13] LiH, Yang SZ, MuBZ, et al. Molecular analysis of the bacterial community in a continental high-temperature and water-flooded petroleum reservoir[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2006, 257(1): 92-98.

[14] Van Hamme JD, Singh A, Ward OP. Recent advances in petroleum microbiology[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2003, 67(4): 503-549.

[15] Takeshi O, Ken IK, Yoshiharu D. Cloning and characterization of the polyhydroxybutyrate depolymerase gene of Pseudomonas stutzeri and analysis of the function of substrate-binding domains[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65 (1): 189-197.