響應(yīng)面法優(yōu)化提取灰樹花堿溶性多糖

柴 麗, 侯 紅 漫, 張 公 亮

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

灰樹花(Grifolafrondosa)是一種藥食兼用的珍稀真菌,含有多種生理活性物質(zhì),但主要活性成分為灰樹花多糖[1]。從灰樹花中提取的多糖主要具有抗腫瘤、治療糖尿病、抗肝炎、抗HIV病毒、抗氧化等[2-5]功效。雖然灰樹花多糖研究報(bào)道很多,但多為灰樹花子實(shí)體多糖,有關(guān)灰樹花液體發(fā)酵菌絲體多糖的報(bào)道與香菇和金針菇多糖相比較少,即便是對(duì)于灰樹花子實(shí)體或菌絲體多糖的研究也只關(guān)注于熱水提取物,水提取后的剩余物一般作廢棄物處理,這就造成了原料的大量浪費(fèi)。實(shí)際上藥用真菌含有不同類型的多糖,用一種提取方法很難將其完全抽提出來[6]?；谝陨锨闆r,本研究主要對(duì)熱水提取后通常被當(dāng)作廢棄物丟棄的菌絲體殘?jiān)M(jìn)行重新利用[7],并用響應(yīng)面分析法(RSM)對(duì)灰樹花菌絲體殘?jiān)崛《嗵堑臈l件進(jìn)行優(yōu)化,為以后灰樹花的綜合利用提供可供參考的理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

灰樹花菌種:大連春天生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 灰樹花堿溶性多糖的提取

菌絲體用蒸餾水反復(fù)浸提,直至苯酚-硫酸法檢測(cè)為陰性。離心后菌絲體殘?jiān)肗aOH溶液作為浸提介質(zhì)進(jìn)行提取,工藝如下:菌絲體殘?jiān)鷫A液浸提→離心→上清液加酸中和→離心去沉淀→上清液濃縮→乙醇沉淀→干燥(得堿溶性粗多糖)。

1.2.2 灰樹花堿溶性多糖的測(cè)定

總糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法；還原糖的測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸法比色法。

堿溶性多糖量=總多糖量-還原糖量

多糖提取率=多糖量/菌絲體干重

1.2.3 灰樹花堿溶性多糖提取條件的響應(yīng)面分析

采用Box-behnken試驗(yàn)方案,根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果,運(yùn)用RSREG(response surface regression)程序?qū)υ囼?yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)灰樹花堿溶性多糖提取量的影響

分別取1 g菌絲體殘?jiān)?在溫度60 ℃、堿濃度0.5 mol/L的條件下,水浴加熱提取1 h,料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60,每組做3個(gè)平行試驗(yàn),測(cè)定堿溶性粗多糖提取率,結(jié)果如圖1所示。

圖1 料液比對(duì)灰樹花堿溶性多糖提取量的影響

Fig.1 Impact of liquid-solid ratio onGrifolafrondosaalkaline polysaccharide extracting

由圖1可知,隨著料液比的不斷增加,多糖提取量呈上升趨勢(shì),當(dāng)料液比超過1∶50時(shí),多糖提取量增加的趨勢(shì)不明顯,考慮到節(jié)約試劑的情況,故選擇料液比為1∶50。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)灰樹花堿溶性多糖提取量的影響

分別取1 g菌絲體殘?jiān)?在溫度60 ℃、料液比為1∶60、堿濃度0.5 mol/L的條件下,分別提取15、30、45、60、75、90 min,每組做3個(gè)平行試驗(yàn),測(cè)堿溶性粗多糖提取量,結(jié)果如圖2所示。從圖2可知,灰樹花堿溶性多糖提取時(shí)間為30 min 時(shí),多糖提取量達(dá)到最大,并且隨著時(shí)間的繼續(xù)增加,多糖提取量反而減少,可能是提取時(shí)間太長(zhǎng),堿溶液改變了多糖的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致多糖含量降低,故選擇提取時(shí)間30 min。

圖2 時(shí)間對(duì)灰樹花堿溶性多糖提取量的影響

Fig.2 Impact of different extraction time onGrifolafrondosaalkaline-soluble polysaccharide extracting

2.1.3 NaOH濃度對(duì)灰樹花堿溶性多糖提取率的影響

分別取1 g菌絲體殘?jiān)?在溫度60 ℃、料液比為1∶60的條件下,NaOH溶液的濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L的條件下提取為1 h,每組做3個(gè)平行試驗(yàn),測(cè)堿溶性粗多糖提取量,結(jié)果如圖3所示。

圖3 NaOH濃度對(duì)灰樹花堿溶性多糖提取量的影響

Fig.3 Impact of different sodium hydroxide concentration onGrifolafrondosaalkaline- soluble polysaccharide extraction

從圖3可以看出,當(dāng)NaOH濃度為0.3 mol/L時(shí),粗多糖干重最大；隨著NaOH濃度的不斷增加,粗多糖干重反而降低?？赡苁荖aOH溶液對(duì)多糖的立體旋光結(jié)構(gòu)有一定破壞作用,當(dāng)堿溶液濃度升高至一定濃度后提取量反而降低,故選擇NaOH濃度為0.3 mol/L。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化灰樹花堿溶性多糖提取條件

通過單因素試驗(yàn)可知,以NaOH濃度X1、料液比X2和提取時(shí)間X3為變量,以灰樹花菌絲體殘?jiān)膲A溶性多糖提取率Y為響應(yīng)值,運(yùn)用響應(yīng)面程序?qū)μ崛l件優(yōu)化,以提高菌絲體殘?jiān)鼔A溶性多糖提取率，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析水平和因素

Tab.1 Response surface method analysis of levels and factors

因素水平-101X10.10.30.5X21∶301∶601∶90X3103050

將X1、X2、X3各個(gè)水平進(jìn)行編碼，試驗(yàn)結(jié)果見表2。在表2中,前12個(gè)點(diǎn)是以自變量X1、X2和X3的取值形成的三維頂點(diǎn)；后3個(gè)點(diǎn)是中心點(diǎn)。為了能準(zhǔn)確地用來估計(jì)試驗(yàn)誤差,在試驗(yàn)過程中,需要對(duì)中心點(diǎn)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。繼續(xù)用RSREG程序?qū)Ρ?中所得結(jié)果進(jìn)行程序分析,結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面分析方案和結(jié)果

Tab.2 Response surface method experimental design and results

試驗(yàn)X1X2X3Y/%1-1-100.352-10-10.393-10-10.514-1100.4850-1-10.4460-110.37701-10.4580110.4691-100.311010-10.30111010.27121100.51130000.65140000.69150000.72

表3 回歸結(jié)果與分析

由表3中數(shù)據(jù)分析可以得出灰樹花菌絲體殘?jiān)鼔A溶性多糖的提取率Y與不同提取因素之間的擬合方程:

Y=-0.545 42+1.281 25X1+0.022 194X2+

0.019 562X3-0.002 916 67X1X2+

0.005X1X3+0.000 104 167X2X3-

通過分析結(jié)果可以作出相應(yīng)的等高線圖及其曲面圖,以確認(rèn)NaOH濃度、料液比和時(shí)間3個(gè)因素對(duì)灰樹花堿溶性多糖提取率的影響,結(jié)果如圖4～6所示。

由圖4可以看出,當(dāng)X1變化時(shí),X2對(duì)灰樹花堿溶性多糖的提取率Y的影響不明顯；同時(shí),當(dāng)X2變化時(shí),X1對(duì)灰樹花堿溶性多糖的提取率Y的影響也不明顯。

圖4 Y=f(X1,X2)的響應(yīng)面立體分析圖

由圖5可以看出,X1、X3也表現(xiàn)出與圖4相似的規(guī)律,但從單個(gè)因素對(duì)Y的影響來看,X3對(duì)Y影響的顯著性要大于X1。

圖5 Y=f(X1,X3)的響應(yīng)面立體分析圖

從圖6可以看出,X2與X3的交互作用顯著,X2取不同值時(shí),X3對(duì)灰樹花堿溶性多糖提取率Y的影響表現(xiàn)出不同程度的變化；同理,當(dāng)X3取不同值時(shí),X2對(duì)灰樹花堿溶性多糖提取率Y的影響也表現(xiàn)出不同的變化。

圖6 Y=f(X2,X3)的響應(yīng)面立體分析圖

通過軟件分析計(jì)算,當(dāng)灰樹花堿提多糖提取率最高時(shí),堿濃度為0.29 mol/L、料液比為1∶66、時(shí)間為33 min。按照最優(yōu)提取條件對(duì)灰樹花菌絲體粉末進(jìn)行多次堿提,計(jì)算灰樹花堿溶性多糖的提取率。多次平行試驗(yàn)得到的實(shí)測(cè)值為0.73%,理論值為0.70%,實(shí)測(cè)值與理論值相比相對(duì)誤差在0.1%之內(nèi),預(yù)測(cè)值與理論值非常接近,偏差較小。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上,通過三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)灰樹花堿溶性多糖的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化,從而建立了各個(gè)因素與響應(yīng)值Y之間的數(shù)學(xué)模型,通過回歸模型確定了灰樹花堿溶性多糖的最佳工藝參數(shù):NaOH濃度為0.29 mol/L,料液比為1∶66,提取時(shí)間為33 min。在最佳條件下,得出灰樹花堿溶性多糖的提取率為0.70%。重復(fù)3次提取試驗(yàn),實(shí)際測(cè)得的平均值為0.73%,與理論值相比,其相對(duì)誤差在0.1%之內(nèi)。因此,采用響應(yīng)面分析法對(duì)灰樹花堿溶性多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化,可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)。

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