響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取連翹葉中連翹苷工藝

王 杰，韓曉彤，董新榮，李 霞*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，湖南 長沙 410128)

連翹[1]（Forsythia suspensa）是木犀科植物連翹屬落葉灌木，性寒、味苦，常以果實(shí)入藥，是中藥中最常見的藥材之一[2-4]，具有清熱解毒、消結(jié)散腫、抗菌及抑制真菌等功能[5]，常見的中成藥如雙黃連口服液、銀翹片等制劑均是以連翹果實(shí)作為主藥[6]。連翹苷和連翹酯苷是中藥連翹的主要生物活性組分[7-8]，也是國家藥典所規(guī)定的連翹質(zhì)量控制指標(biāo)性成分[9]（連翹苷含量不少于0.15%）。研究表明，連翹苷和連翹酯苷均具有較好的抗菌和抗病毒作用[10-12]。

研究顯示，連翹資源在我國非常豐富，且連翹屬植物葉子與果實(shí)的成分有較好的一致性，如連翹葉中連翹苷含量遠(yuǎn)高于連翹果實(shí)，含量差別超過40倍[13]。對連翹葉及連翹果實(shí)的化學(xué)成分分析顯示，連翹苷、連翹脂素、齊墩果酸等生物活性成分在葉中含量均高于果實(shí)[14]，因此連翹葉具有十分廣泛的藥用價值。目前人們對于連翹的藥用價值主要集中在連翹果上，尚未見關(guān)于連翹葉的利用開發(fā)，因此對于其研究不僅有利于擴(kuò)大藥源，而且有利于連翹資源的綜合開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：連翹葉原料購于山西省運(yùn)城市百葉農(nóng)特產(chǎn)有限公司。

試劑：連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院）；乙醇、甲醇均為分析純。

儀器：UV-2450型紫外分光光度計（日本島津），DKS24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 連翹葉中連翹苷的提取方法

稱取4.0g干燥的連翹葉粉末，用一定濃度乙醇溶液浸泡0.5h，在一定功率下微波提取一定時間，過濾收集濾液。

1.2.2 連翹苷的檢測方法

以連翹苷為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用分光光度法測定。測定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.02671x+0.00802（R2=0.99561，n=5）。式中：A為波長229nm 處的吸光度值；x為連翹苷的含量（mg/L）。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確移取一定體積按1.2.1法提取的濾液，定容后紫外分光光度法檢測連翹苷含量。研究乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間、提取功率及提取次數(shù)6個因素對連翹苷得率的影響，確定各因素的最佳范圍，每個因素重復(fù)試驗(yàn)3次，取其平均值。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用5因素5水平的Box-Behnken Design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計[7]，以乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）、微波功率（E）的值為自變量，以連翹苷的得率為因變量，研究響應(yīng)值以及最佳變量的組合[15]。試驗(yàn)因素水平及編碼見表1。整個試驗(yàn)設(shè)計在中心點(diǎn)共有27次試驗(yàn)、3個重復(fù)，試驗(yàn)分2d隨機(jī)完成。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels in the Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對連翹苷得率的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對連翹苷得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration fraction on forsythin yield

在一定溫度、料液比和功率條件下微波提取連翹葉一定時間，考察乙醇濃度對連翹苷得率的影響。由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，連翹苷得率隨之增加。當(dāng)乙醇濃度到達(dá)70%vol以后，連翹苷得率隨著濃度增加變化不明顯，因此單次提取試驗(yàn)中乙醇濃度選擇為70%vol。

2.1.2 料液比對連翹苷得率的影響

在一定溫度、乙醇濃度和功率條件下微波提取連翹葉一定時間，考察料液比對連翹苷得率的影響。由圖2可知，隨著料液比的增加，連翹苷得率隨之增加。當(dāng)料液比為1∶9時，連翹苷得率上升趨勢逐漸變緩，結(jié)合考慮實(shí)際生產(chǎn)的綜合成本及生產(chǎn)效率，所以單次提取試驗(yàn)中料液比選1∶9。

圖2 料液比對連翹苷得率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on forsythin yield

2.1.3 提取溫度對連翹苷得率的影響

圖3 提取溫度對連翹苷得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on forsythin yield

在一定乙醇濃度、料液比和功率條件下微波提取連翹葉一定時間，考察溫度對連翹苷得率的影響。由圖3可知，開始時隨著溫度的增加，連翹苷得率隨之增加。當(dāng)溫度到達(dá)80℃后，隨著溫度的增加連翹苷得率呈現(xiàn)出下降趨勢，這可能是由于高溫導(dǎo)致連翹苷不穩(wěn)定所致，所以單次提取試驗(yàn)中溫度選80℃。

2.1.4 提取時間對連翹苷得率的影響

圖4 提取時間對連翹苷得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on forsythin yield

在一定溫度、乙醇濃度、料液比和功率條件下微波提取連翹葉，考察浸提時間對連翹苷得率的影響。由圖4可知，開始時隨著提取時間的增加，連翹苷得率隨之增加。當(dāng)提取時間達(dá)到7min后，隨著提取時間的增加連翹苷得率呈現(xiàn)出下降趨勢，這可能是由于時間過長導(dǎo)致連翹苷不穩(wěn)定，所以單次提取試驗(yàn)中時間選7min。

2.1.5 微波功率對連翹苷得率的影響

圖5 微波功率對連翹苷得率的影響Fig.5 Effect of microwave power on forsythin yield

在一定溫度、乙醇濃度、料液比條件下微波提取連翹葉一定時間，考察微波功率對連翹苷得率的影響。由圖5可知，開始時隨著提取功率的增加，連翹苷得率顯著升高。當(dāng)功率到達(dá)320W以后，連翹苷得率隨功率的增加明顯下降，這可能是因?yàn)楣β蔬^高造成連翹苷不穩(wěn)定所致，所以單次提取試驗(yàn)中微波功率選擇320W。

2.1.6 提取次數(shù)對連翹苷得率的影響

表2 提取次數(shù)對連翹葉中連翹苷得率的影響Table 2 Effect of extraction times on forsythin yield of leaves of forsythia

在一定溫度、乙醇濃度、料液比和一定微波功率條件下提取連翹葉一定時間，考察提取次數(shù)對連翹苷得率的影響。由表2可知，連續(xù)提取4次以后，Abs的值接近于0，因此不再進(jìn)行第5次提取。用上述方式提取2次時，連翹苷的累積提取率達(dá)到96.67%，此時隨著提取次數(shù)的增加，連翹苷提取率受到的影響不大，綜合考慮提取率及生產(chǎn)成本，提取次數(shù)為2次。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)BBD的中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，確定了5因素5水平的響應(yīng)面分析法，提取次數(shù)均為2次。連翹苷的提取結(jié)果見表3。

2.2.2 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

利用Design-Expert軟件對上述回歸模型進(jìn)行方差分析，由表4可知，回歸模型的失擬項(xiàng)為0.1021，沒有顯著性差異；p值為0.0021，表明模型處理間差異極顯著。其R2值為0.9670，表明此模型能解釋96.70%響應(yīng)值變化，這表明該模型具有良好的相關(guān)性?；貧w模型各項(xiàng)的方差分析還表明，各因素一次項(xiàng)是顯著的，交互項(xiàng)AC、AD、AE和DE，二次項(xiàng)C2、D2、E2都表現(xiàn)為極高的顯著性，說明該模型的擬合度好。

表3 響應(yīng)面設(shè)計和連翹苷得率Table 3 Box-Behnken experimental design matrix and corresponding experimental results of forsythin yield

利用Design Expert軟件，對試驗(yàn)設(shè)計各組合處理得到的連翹苷得率進(jìn)行二次回歸分析，建立多元響應(yīng)面回歸模型。

表4 響應(yīng)值二次模型的方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed response surface quadratic model

圖6 乙醇濃度、料液比、溫度、時間、功率交互作用對連翹苷得率影響響應(yīng)面Fig.6 Response surface plots showing the pair wise interactive effects between every two factors including ethanol concentration,material-to-liquid ratio,extraction temperature,extraction time and microwave power

由回歸方程經(jīng)處理得到的乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間和提取功率之間的交互作用對連翹苷得率影響的響應(yīng)面及其等高線圖見圖6。其中提取時間和提取功率的交互作用對連翹苷得率的影響最為顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面落差較大，乙醇濃度和提取溫度的交互作用次之。其余因素之間的交互作用也表現(xiàn)出較顯著的效果。通過對圖6的分析可以看出，在此5個因素中，料液比對連翹苷得率的影響最為顯著，其余依次為提取功率、乙醇濃度、提取溫度和提取時間。此外，各交互因素的最佳作用點(diǎn)基本都落在了試驗(yàn)范圍之內(nèi)，證明此響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計較為合理。

2.2.3 模型的驗(yàn)證試驗(yàn)

通過連翹苷得率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型解逆矩陣，得出從連翹葉中提取連翹苷的最佳工藝條件參數(shù)為乙醇濃度80%vol，料液比1∶8，提取溫度90℃，提取時間5min，提取功率400W，在此條件下，連翹苷最高得率預(yù)測值0.2904%。為驗(yàn)證RSA法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行連翹苷提取試驗(yàn)，重復(fù)3次得到連翹苷得率的平均值為0.2864%，與理論預(yù)測值相差不大，因此，采用RSA法優(yōu)化得到的提取條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價值。

3 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化出最佳提取條件：乙醇濃度為80%vol，料液比為1∶8，提取溫度為90℃，提取時間為5min，提取功率為400W，在此條件下的連翹苷得率預(yù)測為0.2904%。結(jié)果表明，利用響應(yīng)面法優(yōu)化出的提取工藝模型可以較好的反映出連翹中連翹苷的提取條件，可作為連翹苷的新工藝，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

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