錦州蝦油小黃瓜中耐鹽乳酸菌的生物性能研究

白鳳翎，劉邑娥，馬 馳，李 瑩，呂欣然，石金鑫，勵建榮

（渤海大學(xué) 化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“，食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”遼寧省高校重大科技平臺，遼寧 錦州 121013）

錦州蝦油小黃瓜是由遼西地區(qū)特有的頂花帶刺的小黃瓜用錦州地區(qū)特制的蝦油腌漬而成，色澤碧綠、清脆爽口、氣味葷香，是錦州小菜的特征品種。然而，由于蝦油的鹽含量過高致使產(chǎn)品的風(fēng)味不足，口感欠佳，這也是錦州小菜市場化的最大障礙。在自然條件下，微生物的發(fā)酵作用對腌漬蔬菜產(chǎn)品的風(fēng)味形成、質(zhì)地改善等方面都具有非常重要的作用。乳酸菌發(fā)酵在保持蔬菜原料中原有的營養(yǎng)成分和形成風(fēng)味物質(zhì)的基礎(chǔ)上，還賦予產(chǎn)品具有益生作用的生物學(xué)功效[1]。國外乳酸菌發(fā)酵蔬菜的主要代表是德國的酸白菜（Sauerkraut）、酸黃瓜（Sour cucumber）和韓國的泡菜（Kimchi），德國的酸黃瓜主要由腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），短乳桿菌（Lactobacillus brevis），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖片桿菌（Pediococcus pentosaceus）等多種乳酸菌共同發(fā)酵而成。韓國的泡菜中腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是發(fā)酵過程中的優(yōu)勢乳酸菌菌群，對產(chǎn)品的品質(zhì)起到了主要作用，此外還發(fā)現(xiàn)了新的乳酸菌類群[2]。目前從產(chǎn)品中獲取優(yōu)良的乳酸菌株，進(jìn)行基因序列以及生物學(xué)特性研究[3-6]。國內(nèi)應(yīng)用乳酸菌改善發(fā)酵蔬菜的品質(zhì)，武晉海等[7]以腌漬液作為發(fā)酵劑，結(jié)合植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）進(jìn)行預(yù)發(fā)酵，獲得了2.24%NaCl的低鹽腌漬小黃瓜，使產(chǎn)品品質(zhì)獲得了良好的提升。李春等[8]應(yīng)用純菌接種恒溫發(fā)酵黃瓜研究表明了人工接種乳酸菌可以改善產(chǎn)品品質(zhì)。本文從錦州蝦油腌漬小黃瓜中分離獲得的6株耐鹽乳酸菌，對其抗氧化和產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)生物性能進(jìn)行研究，旨在通過選育優(yōu)良性能的乳酸菌作為發(fā)酵劑對錦州蝦油小黃瓜進(jìn)行品質(zhì)改良，達(dá)到提高產(chǎn)品風(fēng)味、降低產(chǎn)品鹽度和增加產(chǎn)品功能的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

菌株L3、L4、L5、L7、L15、L16，自錦州蝦油小黃瓜中分離，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化初步鑒定，結(jié)果表明菌株L3、L4屬于腸球菌屬（Enterococcussp.），菌株L5、L7、L15、L16均屬于乳桿菌屬（Lactobacillussp.）[9]。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g，牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，無水乙酸鈉4.8g，檸檬酸二銨2.0g，K2HPO42.0g，MgSO40.58g，MnSO40.25g，蒸餾水1.0L，pH6.2～6.4，121℃高壓滅菌15min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LDZX-40S型立式自控電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；BCM-1000A型生物潔凈工作臺，蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱，上海精宏試驗(yàn)儀器有限公司；UV-4802紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；DELTA 320 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均平行測定3次，應(yīng)用Excel2003對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用Origin8.0進(jìn)行作圖。

1.2 方法

1.2.1 菌體和胞外分泌物的制備

將供試菌于MRS培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h后，發(fā)酵液以4000r/min離心20min，收集菌體，并用蒸餾水洗滌3次，最后將乳酸菌細(xì)胞數(shù)調(diào)至106cell/mL，即為菌體。

供試菌于MRS培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h后，收集發(fā)酵液，用蒸餾水將乳酸菌細(xì)胞數(shù)調(diào)至1010cfu/mL，在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，收集上清液，即為胞外分泌物。

1.2.2 耐鹽乳酸菌抗氧化性能測定

清除羥自由基試驗(yàn)：參考文獻(xiàn)[10]中的方法，按公式（1）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A為不含樣品液含H2O2的吸光度值；A0為不含樣品液和H2O2時溶液的吸光值；Ai為含樣品液和H2O2的吸光度值。

清除DPPH自由基試驗(yàn)：按文獻(xiàn)[11]方法略作修改。取1mL樣品液，加入0.2mmol/L的DPPH無水乙醇溶液2mL，在517nm下測定吸光度值，按公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：Ai為DPPH和樣品的吸光度值；Aj為乙醇和樣品的吸光度值；A0為DPPH和乙醇的吸光度值。

還原能力測定：按文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。

清除超氧陰離子自由基試驗(yàn)：在4.5mL的25℃水浴20min Tris-HCl緩沖液（PBS：0.05mol/L，pH8.2）中，加入4.4mL菌株樣品液和0.1mL鄰苯三酚溶液（25.0mmol/L），25℃水浴5min。然后加入1.0mLHCl（8.0mol/L），用10.0mmol/L HCl作空白，在325nm處測吸光度值。分別測定乳酸菌菌體、胞外分泌物，按公式（3）計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率。

式中Ai為樣品液的吸光度值；A0為生理鹽水（空白）的吸光度值。

1.2.3 耐鹽性乳酸菌風(fēng)味物質(zhì)測定

乙醛含量測定：按文獻(xiàn)[13]中方法進(jìn)行，將活化后的乳酸菌培養(yǎng)液在4℃下以4000r/min離心20min，收集上清為樣品液，按公式（4）進(jìn)行計(jì)算乙醛含量。

式中：V1為碘標(biāo)準(zhǔn)溶液用量；V2為空白試驗(yàn)碘標(biāo)準(zhǔn)溶液用量；M為碘標(biāo)準(zhǔn)溶液摩爾濃度。

雙乙酰含量測定：按文獻(xiàn)[14]的操作方法進(jìn)行，按公式（5）計(jì)算雙乙酰含量。

式中：E為吸光度值；2.4為吸光度值和雙乙酰含量的換算關(guān)系；0.01為校正值。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐鹽乳酸菌的抗氧化性能

2.1.1 乳酸菌的清除羥自由基性能

6株耐鹽乳酸菌清除羥自由基的作用如圖1所示，可以看出菌體對羥自由基的平均清除率為胞外分泌物的22倍，因此，對羥自由基的清除作用主要來自于具體本身。其中，菌株L7的清除作用最強(qiáng)，清除率達(dá)38.56%；其次是菌株L3，清除率超過30%，最差的為菌株L17。乳酸菌的抗氧化性能在菌體、菌體破碎物、發(fā)酵產(chǎn)物在自由基或過氧反應(yīng)體系中，均表現(xiàn)出不同程度的抗氧化性能[15-17]。從錦州腌漬小黃瓜中耐鹽乳酸菌的清除羥自由基能力主要表現(xiàn)在菌體，而不在其產(chǎn)物或發(fā)酵液中，說明是菌體內(nèi)的氧化酶體系可能發(fā)揮主體作用。當(dāng)菌體被破碎及產(chǎn)物中該酶體系被破壞，清除能力損失殆盡。

圖1 6株耐鹽乳酸菌對羥自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effects of six salt-tolerance LAB strains on hydroxyl radical

2.1.2乳酸菌的清除DPPH自由基性能

表1 6株乳酸菌對DPPH自由基的清除作用Table 1 Scavenging effects of six LAB strains on DPPH radical

6株耐鹽乳酸菌清除DPPH自由基的作用由表1所示，從表1中可以看出乳酸菌胞外分泌物的清除作用明顯強(qiáng)于菌體，其中菌株L16的胞外分泌物對DPPH自由基的作用最強(qiáng)，清除率達(dá)40%；其次是菌株L7，清除率為33.65%；其余菌株在14.3%到31.2%之間。這主要是因?yàn)榫w能產(chǎn)生有一些抗氧化酶和一些抗氧化物質(zhì)，從而使得胞外分泌物的還原能力比菌體強(qiáng)[18]。

2.1.3 乳酸菌的還原性能

圖2 6株耐鹽乳酸菌的還原能力Fig.2 Results of reducing ability of six salt-tolerance LAB strains

由圖2可知，6株乳酸菌菌體以及胞外分泌物均有較強(qiáng)還原能力，且它們的胞外分泌物的還原能力均較菌體的還原能力強(qiáng)。菌株胞外分泌物的還原能力試驗(yàn)所得吸光度值在0.449～1.591之間，還原能力最強(qiáng)的為菌株L3，其吸光度值為1.591；其次為菌株L7，吸光度值為0.875，最差的為菌株L15。

2.1.4 乳酸菌的清除超氧陰離子自由基性能

由圖3可知，胞外分泌液和菌體對超氧陰離子都具有清除作用。與菌體比較而言，胞外分泌具有更強(qiáng)的清除作用。菌株中L7的作用最佳，清除率達(dá)36.63%，其他菌株的胞外分泌液清除率在10%～30%之間。

2.2 乳酸菌形成風(fēng)味物質(zhì)性能

乳酸菌形成乙醛和雙乙酰兩種風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)果如表2所示，6株乳酸菌產(chǎn)生的乙醛含量較高，其中菌株L16產(chǎn)生的含量最高超過了5.5μg/mL；其次是菌株L7，產(chǎn)生的乙醛含量為5.02μg/mL；菌株L3、L4、L5、L15產(chǎn)生的乙醛含量相近，均在2.5～3.5μg/mL之間。而產(chǎn)生的雙乙酰含量相對較低，產(chǎn)生最多的是菌株L7，含量為3.65μg/mL；其次是菌株L15；菌株L16的含量最少，幾乎不產(chǎn)生。乙醛和雙乙酰都是由乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的醇、醛、酮等多種風(fēng)味物質(zhì)和乳酸菌在糖酵解過程中產(chǎn)生的乳酸、乙酸、丙酸等有機(jī)酸相互作用形成的，具有獨(dú)特風(fēng)味的物質(zhì)[19]。

圖3 6株乳酸菌對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of six salt-tolerance LAB strains on superoxide anion free radical

表2 6株乳酸菌乙醛和雙乙酰測定結(jié)果Table 2 Determination results of acetaldehyde and diacetyl of six LAB strains

3 結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，菌株L7對羥自由基的清除率為38.56%，DPPH自由基清除率為33.65%，還原能力較強(qiáng)，超氧陰離子清除率為36.65%；其中，除羥自由基的清除作用來自于菌體自身的抗氧化性能外，其余抗氧化能力均來自于乳酸菌胞外分泌物。與此同時，菌株L7還能產(chǎn)生含量較高的風(fēng)味物質(zhì)：乙醛和雙乙酰的含量分別為5.02μg/mL和3.65μg/mL。因此，綜合耐鹽性乳酸菌菌株清除各種自由基和產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的性能，從中篩選出菌株L7作為改進(jìn)錦州腌漬小黃瓜品質(zhì)的試驗(yàn)菌株。

耐鹽性乳酸菌是腌制蔬菜制品中的優(yōu)勢菌群，對產(chǎn)品的質(zhì)量有著致關(guān)重要的影響。本實(shí)驗(yàn)從錦州傳統(tǒng)風(fēng)味食品蝦油小黃瓜發(fā)酵液分離篩選出的6株具有較好耐鹽性的乳酸菌中，得到生物性能較強(qiáng)的L7菌株。通過對耐鹽性乳酸菌的性能研究篩選出優(yōu)良菌株L7，旨在提高乳酸菌發(fā)酵性能，為提升錦州腌漬小菜產(chǎn)品質(zhì)量、改善其風(fēng)味以及降低含鹽量提供理論基礎(chǔ)。

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