自發(fā)性高血壓大鼠心室重構及脂聯(lián)素受體1的表達

林書坡 周更蘇(邢臺市人民醫(yī)院心內科，河北 邢臺 054000)

脂聯(lián)素(APN)具有改善胰島素抵抗、抗動脈粥樣硬化、抗炎等作用。APN主要通過與其靶器官和組織上相應受體結合而發(fā)揮其病理生理作用。近來研究發(fā)現(xiàn)，APN與高血壓所致的心室重構有密切關系，APN可能對心室重構有抑制作用〔1〕。Yamauchi等〔2〕于2003年首次克隆出人類和小鼠脂聯(lián)素受體。APN主要有兩種受體:脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)和脂聯(lián)素受體2(AdipoR2)。心肌組織主要表達AdipoR1〔3〕。目前，關于心肌組織AdipoR1與高血壓所致心室重構研究較少。因此，本研究擬通過對SHR大鼠心室重構情況和心肌AdipoR1及其mRNA表達水平的變化研究，旨在探討AdipoR1在高血壓所致心室重構中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級12周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)為實驗組，相同周齡的雄性京都Wistar大鼠(WKY)為對照組，每組8只。體重(271±30)g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號為SCXK(京)2007-0001。自由飲食，每兩周測一次血壓和體重，12 w后進行超聲心動圖檢查及取材測定各指標。

1.2 主要的試劑與儀器 兔抗大鼠AdipoR1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)、β-actin小鼠抗大鼠單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)、Trizol Reagent(美國 Invitrogen Life Technologies公司)、RT-PCR試劑盒和 DNA Marker(大連 TaKaRa公司)、PCR引物(北京華大基因公司合成)、凱基全蛋白提取試劑盒(南京凱基生化有限公司)、硝酸纖維素膜(Millopore公司)、羥脯氨酸測定試劑盒和Masson染色試劑盒(南京建成生物公司)、Philips iE33型彩色多普勒超聲儀(Philips公司)、PCR擴增儀(德國Biometra)。

1.3 大鼠收縮壓的測量 應用尾套式小動物血壓測量計測定大鼠血壓，步驟如下:固定大鼠尾部，于白熾燈下照射加熱約10 min，使大鼠尾部血管擴張后將尾部套于壓敏傳感器上。在大鼠清醒、安靜的狀態(tài)下，應用生物信號采集處理系統(tǒng)直接同步記錄尾動脈壓力和脈搏曲線，當出現(xiàn)第1個脈搏波時向尾套氣囊內充氣，逐漸阻斷大鼠尾動脈血流直至脈搏波完全消失，然后放氣至第1個脈搏波重新出現(xiàn)，此波所對應的壓力值即為收縮壓。

1.4 超聲心動圖評價大鼠左心室結構和功能 腹腔注射3%戊巴比妥鈉35 mg/kg麻醉大鼠后，胸部備皮，仰臥位固定，略向左側傾斜，將探頭置于大鼠胸部正中位或略偏左對大鼠進行超聲檢查，取得滿意的胸骨旁左心室長軸二維圖像后，M型超聲心動圖測定左心室舒張末期內徑(LVEDD)、舒張末期室間隔厚度(IVST)及左室后壁厚度(LVPWT)。調整脈沖多普勒掃描速度，將取樣容積放在二尖瓣與左室流出道之間描記多普勒血流頻譜圖，測定二尖瓣口舒張早期和舒張晚期血流E峰、A峰峰值流速，計算E/A比值。

1.5 左心室重量指數(shù)(LVWI)的測量及心肌標本的采集 采血后迅速取出心臟，生理鹽水沖洗殘血，濾紙吸干，去除大血管殘根和結締組織，沿房室交界處剪去心房，沿室間隔剪去右心室，保留室間隔和左心室，稱左心室重量。LVWI=左心室重量(mg)/體重(g)。切取部分左室游離壁心肌，4%多聚甲醛中固定備用。其余心肌置液氮罐中冷凍后，－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 心肌形態(tài)學觀察 心肌形態(tài)學觀察心肌組織HE染色，觀察組織病理形態(tài)學變化。Masson染色，光鏡下觀察并拍片，用圖像分析系統(tǒng)測定并計算心肌膠原容積分數(shù)(CVF)。CVF=心肌膠原面積/所測視野面積，所有標本均隨機取4個視野測量，取平均值。

1.7 羥脯氨酸(Hyp)含量測定 取凍存心肌100 mg，脫水，脫脂，將沉淀烘干并研成粉末。取20 mg干粉，加入6 mmol/L HCl 3 ml，放入試管中于95℃水浴20 min，冷卻后用6 mmol/L NaOH調pH值至6.0，加水至10 ml，3 500 r/min離心10 min。過濾取上清液，按照Hyp檢測試劑盒的要求檢測，計算Hyp含量。

1.8 RT-PCR方法檢測心肌組織AdipoR1 mRNA表達 Trizol一步法提取總RNA，利用紫外分光光度計測定并計算總RNA濃度和純度，將總RNA濃度經(jīng)DEPC處理的雙蒸水調整至1 μg/μl，按照RT-PCR試劑盒說明，用 AMV逆轉錄酶將 RNA逆轉錄為cDNA。設計并合成大鼠AdipoR1引物，上游引物序列:5'-ATCCGCAGGTCAACG-3'，下游引物序列:5'-GGAGGAGGGCATAGGT-3'，PCR擴增片段長度526 bp。選用β-actin為內參照，上游引物序列5'-GCCAACCGTGAAAAGATG-3'，下游引物序列5'-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3'，PCR擴增片段長度701 bp。擴增條件為 94℃ 5 min，98℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)，72℃ 10 min。取10 μl擴增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上顯影照相，用凝膠成像分析軟件分析，計算AdipoR1 mRNA的相對表達量。AdipoR1 mRNA表達量的相對值=AdipoR1基因擴增條帶的灰度值/β-actin基因擴增條帶的灰度值。

1.9 Western印跡方法檢測心肌AdipoR1蛋白的表達 取凍存心肌組織100 mg勻漿器勻漿，凱基全蛋白提取試劑盒提取心肌組織總蛋白質，Bradford法蛋白定量，取標本蛋白50 μl上樣，經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠(10%SDSPAGE)電泳分離蛋白，轉移至硝酸纖維素膜，5%去脂奶粉的TTBS封閉4℃過夜。TBS洗膜5 min×3次，加入1∶400稀釋的AdipoR1兔抗大鼠多克隆抗體、β-actin小鼠抗大鼠單克隆抗體，室溫下2 h。清洗:TTBS洗5 min×2次，TBS洗5 min×1次。酶顯法顯色劑顯色。掃描，凝膠成像分析系統(tǒng)成像，測定各條帶灰度值，記錄結果。計算各蛋白帶灰度值/內參β-actin蛋白灰度值的比值。

2 結果

2.1 收縮壓變化 SHR組大鼠收縮壓隨周齡的增長而逐漸升高，而WKY組收縮壓無顯著變化。兩組收縮壓在同一時期均具有顯著差異(P＜0.01)。見圖1。SHR大鼠具有收縮壓持續(xù)升高的特點，是研究高血壓的理想動物模型。

2.2 超聲心動圖各指標的比較 與WKY組相比，SHR組IVST和LVPWT均增加，LVEDD和E/A值降均低，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。各組大鼠左室壁及室腔各切面顯示較清晰。提示SHR大鼠心室肥厚和左室舒張功能有所降低。

2.3 LVWI的比較 SHR組大鼠LVWI明顯升高，與WKY組比較差異顯著(P＜0.05)。見表2。

2.4 心肌形態(tài)學的改變 WKY組大鼠心肌細胞大小及染色未見異常，排列規(guī)整;SHR組大鼠心肌纖維體積增大，染色相對不均勻，排列紊亂，心肌纖維，心肌間質成纖維細胞肥大增生。見圖2。

2.5 心肌組織Masson染色及CVF的比較 Masson染色下心肌細胞呈紅色，膠原呈藍色。WKY組大鼠心肌間質可見少量膠原，主要位于血管周圍。SHR組大鼠心肌組織中膠原明顯增多，呈柵欄狀排列緊裹心肌細胞。見圖3。SHR組CVF顯著高于WKY組(P＜0.05)。見表2。

2.6 心肌組織Hyp含量的比較 SHR組Hyp含量顯著高于WKY組(P＜0.05)。Hyp含量可反映心肌膠原含量，結果提示SHR大鼠心肌膠原增多。見表2。

表1 各大鼠超聲心動圖指標比較(n=8，±s)

表1 各大鼠超聲心動圖指標比較(n=8，±s)

與WKY組比較:1)P＜0.05

組別 IVST(mm)LVPWT(mm)LVEDD(mm)E/A WKY組1.37±0.17 1.28±0.08 6.19±0.34 1.90±0.05 SHR組 1.67±0.191)1.53±0.161)5.24±0.211)1.52±0.111)

圖1 各組大鼠收縮壓水平的變化

圖2 心肌形態(tài)學改變(HE，×400)

圖3 心肌Masson染色(×400)

表2 各組LVWI、CVF、Hyp含量比較(n=8，±s)

表2 各組LVWI、CVF、Hyp含量比較(n=8，±s)

與WKY組比較:1)P＜0.05

組別 LVWI(mg/g) CVF(%) Hyp(μg/g)WKY組2.59±0.09 3.17±0.31 326.4±37.5 SHR組 2.93±0.121) 6.25±0.291) 523.8±65.31)

2.7 心肌AdipoR1 mRNA表達的比較 SHR組心肌組織AdipoR1 mRNA表達(0.39±0.03)顯著低于 WKY組(0.78±0.06)，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖4。

圖4 RT-PCR分析AdipoR1 mRNA在心肌的表達

2.8 心肌AdipoR1蛋白表達的比較 與WKY組(0.73±0.26)相比，SHR組(0.37±0.03)心肌組織 AdipoR1蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05)。見圖5。

圖5 Western印跡方法分析心肌組織AdipoR1蛋白表達

3 討論

APN是由Scherer等〔3〕于1995年在小鼠脂肪細胞中發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質。脂聯(lián)素主要在脂肪細胞表達，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)機體多種組織均有表達。以往研究顯示，脂聯(lián)素具有調節(jié)糖脂代謝、改善胰島素抵抗、抗動脈粥樣硬化、抗炎等作用。APN以內分泌方式循環(huán)于血液中，通過與其靶器官和組織上相應受體結合而發(fā)揮其病理生理作用。

2003 年，Yamauchi等〔2〕首次克隆出人類和小鼠脂聯(lián)素受體，并發(fā)現(xiàn)有2種APN受體:AdipoR1和AdipoR2。人和鼠AdipoR1基因有96.8%的同源性。AdipoR1主要表達在骨骼肌細胞，對APN的球狀結構域具有高親和力，但對全長APN親和力低。而AdipoR2主要表達在肝細胞，對兩者具有中等親和力。此外，內皮細胞、單核細胞、胰島β細胞、巨噬細胞和受損血管內皮細胞等均有APN受體的表達。有研究證明，AdipoR1和AdipoR2也存在于心肌細胞，其中以AdipoR1為主〔4〕。APN受體包含7個跨膜結構域，但它們的N端在細胞內，C端在細胞外，這與G蛋白偶聯(lián)受體的結構相反，因此APN受體可能不與G蛋白偶聯(lián)發(fā)揮作用，而直接激活下游一些信號分子如過氧化物酶體增殖物激活受體 α(PPARα)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和p38絲裂原活化蛋白激酶而發(fā)揮作用。

最近越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，APN與高血壓發(fā)生密切相關。Matsubara等〔5〕研究表明，血漿APN的濃度在高血壓患者低于正常人群。Kubota等〔6〕發(fā)現(xiàn)APN敲除(KO)小鼠在動脈受機械損傷后內膜增生比野生小鼠嚴重，而感染攜帶有APN基因的腺病毒之后卻能完全扭轉動脈內膜的過度增生，證明脂聯(lián)素是內生的血管保護者。越來越多的研究支持APN作為一種保護因子參與高血壓的發(fā)生。APN可能是通過調節(jié)血管結構和功能以及調節(jié)血脂等作用而對高血壓產(chǎn)生間接作用。

關于APN與高血壓靶器官損害方面的研究較少。Mitsuhashi等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)低脂聯(lián)素是左室肥厚的獨立危險因素。Shibata等〔7〕研究也表明，在APN基因敲除小鼠，用壓力負荷方式極易誘導出心肌肥厚，增加死亡率。而將腺病毒攜帶的APN基因重新轉入體內后可以逆轉這種趨勢。Huang等〔8〕最新研究發(fā)現(xiàn)，APN和AdipoR1在體外培養(yǎng)的大鼠成纖維細胞高度表達，APN對成纖維細胞增生有抑制作用。目前APN在高血壓心肌重構中作用機制尚不清楚?？赡軝C制為高血壓時壓力負荷增加、交感神經(jīng)興奮等因素導致兒茶酚胺增多和RASS激活，這些神經(jīng)體液因子可以作用于脂肪細胞以及其他能分泌APN的組織細胞，使得脂聯(lián)素分泌減少，同時，下調心肌細胞膜上AdipoR1表達，從而使磷酸腺苷激活的蛋白激酶磷酸化激活減少〔7〕，使心肌能量代謝發(fā)生障礙及其對蛋白合成抑制作用減弱，導致高壓力負荷狀態(tài)下心室重構的發(fā)生。目前，關于這一機制的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)24周齡SHR有心室重構發(fā)生，SHR大鼠發(fā)生了左室心肌肥厚。另外，Hyp是機體膠原蛋白特有的一種氨基酸，除彈性蛋白含有少量羥脯氨酸(1%)外，幾乎所有Hyp都存在于膠原蛋白中。本研究提示心肌間質發(fā)生一定程度的纖維化，心肌AdipoR1表達的下調可能與高血壓心室重構有關。至于APN與AdipoR1結合后是通過AMPK信號通路還是其他的信號通路，或者各通路共同作用而在高血壓心室重構發(fā)揮作用，尚不清楚，還有待更深入的研究。

隨著人們對APN及其受體在高血壓以及高血壓心室重構發(fā)病機制中研究的不斷深入，人們將會逐漸認清其作用機制，AdipoR1激動劑有可能成為臨床新藥研發(fā)和高血壓及高血壓靶器官損害治療的新思路。

1 Mitsuhashi H，Yatsuya H，Tamakoshi K，et al.Adiponectin level and left ventricular hypertrophy in Japanese men〔J〕.Hypertension，2007;49(6):1448-54.

2 Yamauchi T，Kamon J，Ito Y，et al.Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects〔J〕.Nature，2003;423(6941):726-9.

3 Scherer PE，Williams S，F(xiàn)ogliano M，et al.A novel serum protein similar to Clq，produced exclusively in adipocytes〔J〕.J Biol Chem，1995;270(45):26746-9.

4 Fujioka D，Kawabata K，Saito Y，et al.Role of adiponectin receptors in endothelin-induced cellular hypertrophy in cultured cardiomyocytes and their expression in infarcted heart〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006;290(6):2409-16.

5 Matsubara M，Maruoka S，Katayose S.Inverse relationship between plasma adiponectin and leptin concentrations in normal-weight and obese women〔J〕.Eur J Endocrinol，2002;147(2):173-80.

6 Kubota N，Terauchi Y，Yamauchi T，et al.Disruption of adiponectin causes insulin resistance and neointimal formation〔J〕.J Biol Chem，2002;277(29):25863-6.

7 Shibata R，Ouchi N，Ito M，et al.Adiponectin-mediated modulation of hypertrophic signals in the heart〔J〕.Nat Med，2004;10(12):1384-9.

8 Huang D，Yang C，Wang Y，et al.PARP-1 suppresses adiponectin expression through poly(ADP-ribosyl)action of PPAR gamma in cardiac fibroblasts〔J〕.Cardiovasc Res，2009;81(1):98-107.