人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植后在心肌梗死大鼠體內(nèi)的定植及分化

王鈺瑩 方 寧 陳代雄 余麗梅 劉祖林 萬 雪

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實驗室，貴州 遵義 563003)

成體干細(xì)胞(SSC)具有一定的發(fā)育潛能，在適當(dāng)?shù)臈l件下可分化成特化的組織細(xì)胞，而且來源較廣，可體外擴(kuò)增，不牽涉?zhèn)惱韺W(xué)問題，因而在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAD-MSCs)也是一類典型的SSC，它具有易于體外擴(kuò)增，無免疫原性、多分化潛能等優(yōu)點(diǎn)，可以成為細(xì)胞移植治療缺血性心肌病的一種有前途的新細(xì)胞來源〔1～4〕。移植途徑是影響細(xì)胞移植治療效果和安全性的重要因素，在動物實驗和臨床試驗中采用的細(xì)胞移植途徑包括心肌內(nèi)注射、冠狀動脈內(nèi)注射、冠狀靜脈竇移植等。而經(jīng)靜脈內(nèi)移植，由于可以反復(fù)、多次、大量進(jìn)行無創(chuàng)的治療，是最具有應(yīng)用前景的治療方法。本實驗旨在觀察靜脈移植hAD-MSCs到心肌梗死 (MI)大鼠體內(nèi)后在重要臟器的分布以及對心功能的影響，探討靜脈移植hAD-MSCs治療MI的可行性和安全性。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，體重(200±20)g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物實驗中心〔許可證號:SCXK(渝)2007-0005〕。LG-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)、鼠抗人Brdu抗體、α-輔肌動蛋白抗體購自Sigma公司，連接蛋白-43(CX-43)抗體、羊抗鼠IgG-FITC、羊抗兔Ig-Texas Red購自Santa Cruz公司，鼠抗人細(xì)胞核特異性抗體MAB1281、結(jié)蛋白抗體購自Chemcion公司，免疫組化單染試劑盒(EnVisionTMDetection Systems Peroxidase/DAB，兔/鼠)購自Gene Tech公司，用于流式細(xì)胞儀檢測的全部熒光標(biāo)記抗體均購自BD公司，彩色多普勒超聲心動圖儀為德國ACUSON公司產(chǎn)品(型號Sequoia512)。

1.2 hAD-MSCs分離、培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記 經(jīng)知情同意后，采自足月剖宮產(chǎn)分娩胎盤，剝離羊膜，D-Hank液反復(fù)沖洗，剪碎羊膜，0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶37℃消化20 min，反復(fù)3次，棄上清液，去除羊膜上皮細(xì)胞。0.75 mg/mlⅡ型膠原酶，0.075 mg/ml DNaseⅠ，37℃，200 r/min 旋轉(zhuǎn)消化 2 h，300 目不銹鋼網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞濾液，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，細(xì)胞重新懸浮于含10%FBS的 L-DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞增殖達(dá)80%融合時細(xì)胞傳代，取第3代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原 CD44、CD73、CD90、CD 105、CD45、CD34、CD11b、CD19 及 HLA-DR 的表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測波形蛋白。取第3代細(xì)胞以5×105/cm2細(xì)胞密度分別接種，接近50%融合時，加入Brdu(終濃度為10 μg/ml)，孵育48 h，收集Brdu標(biāo)記的細(xì)胞供移植時使用。

1.3 大鼠MI模型的建立及hAD-MSCs移植〔5〕10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔麻醉，氣管插管，在心電監(jiān)護(hù)下，左胸第2～3肋間隙開胸，于左心耳下方1～2 mm處用6/0號絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，心電圖示R波振幅升高，ST段(J點(diǎn))抬高可確定建模成功。術(shù)后腹腔注射青霉素20 IU/kg連續(xù)7 d。實驗設(shè)模型組、hAD-MSCs移植組和假手術(shù)組各12只。移植組經(jīng)舌下靜脈注入 Brdu標(biāo)記的 hAD-MSCs懸液0.4 ml(2×106個細(xì)胞/只)，模型組和假手術(shù)組分別經(jīng)相同途徑注射等體積無血清培養(yǎng)基。

1.4 心臟功能檢測 分別于制模前，制模后1 w及移植后6 w采用彩色多普勒超聲心動圖儀(15 MHz探頭)檢測左室心功能，檢測時探頭置于大鼠胸前，調(diào)整角度取胸骨旁左室長軸和乳頭肌水平短軸切面。檢測指標(biāo)包括射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)、舒張期左室前壁厚度(LVAWd)、收縮期期左室前壁厚度(LVAWs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左室舒張末期容積(EDV)和左室收縮末期容積(ESV)。每項指標(biāo)連續(xù)測定3次，取平均值。

1.5 組織學(xué)、免疫組化和免疫熒光檢測 心功能測定結(jié)束后處死動物，取心、肝、肺和脾臟組織置于4%多聚甲醛中固定，20%蔗糖溶液脫水，石蠟包埋，按5μm厚度連續(xù)切片，脫蠟水化，心肌組織行HE染色。免疫組化染色:組織切片經(jīng)脫蠟至水，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，DNA變性，山羊血清封閉后，加鼠抗人Brdu單抗，4℃孵育過夜，加兔鼠通用二抗。DAB顯色，顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈棕褐色者為Brdu標(biāo)記陽性細(xì)胞。免疫熒光染色:取心臟剝離左心室，經(jīng)OCT包埋后連續(xù)切成5 μm超薄切片，室溫晾干，Triton X-100作用，山羊血清封閉后，加入小鼠抗人細(xì)胞核特異性抗體MAB1281與CX-43抗體或α-actinin抗體的混合抗體，4℃孵育過夜，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG與德克薩斯紅(TR)標(biāo)記的羊抗兔IgG混合的二抗，37℃避光孵育2 h。甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 hAD-MSCs形態(tài)、表型特征及Brdu標(biāo)記效果 hAD-MSCs形態(tài)為梭形或多角形，細(xì)胞排列緊密，胞體拉伸，呈單層放射狀或漩渦狀生長，增殖迅速。免疫組化染色顯示hAD-MSCs表達(dá)波形蛋白，增殖期hAD-MSCs的Brdu標(biāo)記陽性率達(dá)90%以上(圖1)。FCM分析結(jié)果顯示，分離的hAD-MSCs高表達(dá)CD44、CD90、CD73 和 CD105，幾乎不表達(dá) CD45、CD34、CD11b、CD19及 HLA-DR(圖2)。

圖1 hAD-MSCs生長形態(tài)及波形蛋白和Brdu標(biāo)記細(xì)胞的免疫組化染色

圖2 hAD-MSCs流式細(xì)胞術(shù)表型分析結(jié)果

2.2 心肌組織病理變化 HE染色結(jié)果顯示，模型組MI區(qū)，可見心肌纖維腫脹，心肌細(xì)胞核消失，間質(zhì)出血，心肌細(xì)胞壞死，伴大量急性炎癥細(xì)胞浸潤;hAD-MSCs移植組移植后6 w炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，新生毛細(xì)血管增多，形成瘢痕組織(圖3)。

2.3 hAD-MSCs經(jīng)靜脈移植后在心、肝、肺和脾臟中的分布細(xì)胞移植后6 w的組織切片中可見Brdu標(biāo)記的陽性細(xì)胞，主要分布于MI組織與正常組織的交界區(qū)域，細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核呈棕褐色，而正常心肌組織未見陽性細(xì)胞。hAD-MSCs除可以分布在梗死心肌組織外，肺和脾臟組織中亦可見部分hADMSCs存活，但肝臟中未見hAD-MSCs。見圖4。

2.4 hAD-MSCs在MI大鼠心臟中的定植及分化 移植的hAD-MSCs主要定位于梗死區(qū)及邊緣區(qū)，免疫熒光雙染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)人細(xì)胞核抗原與CX-43、α-輔肌動蛋白陽性細(xì)胞同時表達(dá)，提示移植的hAD-MSCs在MI向心肌細(xì)胞分化(圖5)。

2.5 hAD-MSCs經(jīng)靜脈移植后對心功能的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心功能各項指標(biāo)均發(fā)生異常(均P＜0.05)，表現(xiàn)為明顯的收縮和舒張功能障礙。與模型組比較，移植組心功能各項指標(biāo)明顯改善，尤其是反映左心室收縮功能的EF、FS和反映左心室前壁厚度的LVAWd和LVAWs，明顯高于模型組(P＜0.01)(圖6)。

圖3 hAD-MSCs移植后MI區(qū)病理變化(×200)

圖4 hAD-MSCs靜脈移植后6 w在MI區(qū)和主要器官中的分布(×200)

圖5 hAD-MSCs移植后6 w在心肌原位表達(dá)心肌細(xì)胞特異性蛋白

圖6 hAD-MSCs移植后對MI大鼠心功能的影響

3 討論

干細(xì)胞移植是近年來心肌損傷修復(fù)研究的一個熱點(diǎn)問題，很多動物實驗和臨床研究均證實，干細(xì)胞移植對受損心肌組織的修復(fù)以及心功能改善有積極的作用。通過何種途徑將移植細(xì)胞輸送到受損心肌組織內(nèi)也成為眾多學(xué)者的研究方向。經(jīng)冠脈內(nèi)、心內(nèi)膜和心外膜直視注射移植細(xì)胞雖然移植成功率較高，但都因技術(shù)要求高及具有創(chuàng)傷性，增加了患者的痛苦，臨床應(yīng)用受到限制。Orlic等〔6〕嘗試了經(jīng)靜脈途徑移植干細(xì)胞保護(hù)梗死心臟，結(jié)果表明靜脈移植方式能有效地改善左心室功能，縮小梗死面積。Nagaya等〔7〕從同源大鼠分離出MSCs，通過靜脈注入移植后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞先到達(dá)梗死心肌，且表達(dá)心肌特異性標(biāo)記結(jié)蛋白、肌鈣蛋白T、連接蛋白43。本實驗選擇在MI后1 w移植細(xì)胞，考慮到MI早期的炎癥性反應(yīng)不利于細(xì)胞的存活，而梗死后1 w炎癥反應(yīng)漸于消退，很多細(xì)胞因子表達(dá)處于高峰期，有利于移植細(xì)胞向受損區(qū)域遷移〔8〕。

肺臟是移植細(xì)胞最先移行的臟器，Gao等〔9〕靜脈注射MSCs進(jìn)行骨組織修復(fù)和Fischer等〔10〕靜脈注射MSCs修復(fù)豬MI的研究顯示，由于肺的“首關(guān)效應(yīng)”，移植后大部分細(xì)胞被肺血管所“俘獲”，使細(xì)胞無法通過而導(dǎo)致大量細(xì)胞滯留于肺組織中。本研究表明靜脈移植的hAD-MSCs可以通過血液循環(huán)遷移到MI區(qū)的心肌組織內(nèi)。此外，在脾臟中也可見少量滯留的細(xì)胞，這可能是由于移植細(xì)胞受到肺循環(huán)中豐富血流不斷沖刷，細(xì)胞得以逃逸到其他組織器官中，這些與其他研究結(jié)果一致〔11〕。本研究中肝臟組織未見有細(xì)胞存留，這可能與細(xì)胞遭受炎癥、免疫等因素影響后出現(xiàn)凋亡或死亡，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少而未檢測到。這些結(jié)果表明移植細(xì)胞能夠定植于MI區(qū)域及周邊區(qū)域，并分布在重要器官中，說明供體細(xì)胞具有向受損心肌組織遷徙特性，且提示細(xì)胞通過簡便的靜脈移植途徑治療MI是可行的。

hAD-MSCs經(jīng)靜脈注射后不僅有細(xì)胞分布到MI區(qū)域，而且還能夠保護(hù)心臟功能，延緩梗死后左心室的重構(gòu)。本實驗研究表明移植hAD-MSCs可在一定程度上抑制MI后心室重構(gòu)，對防止因心室重構(gòu)而導(dǎo)致的心力衰竭具有積極意義。本實驗說明hAD-MSCs移植后可在大鼠MI區(qū)向心肌細(xì)胞分化。hAD-MSCs移植可改善MI后心臟功能。即便還沒有證據(jù)證明hAD-MSCs分化成的心肌樣細(xì)胞直接參與了心臟的收縮功能，但有一點(diǎn)是可以肯定，即hAD-MSCs抑制MI后心室重構(gòu)是其提高心功能的重要的病理生理學(xué)機(jī)制。

關(guān)于移植細(xì)胞對MI后的心肌修復(fù)的作用機(jī)制尚不十分清楚，可能與供體細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞，促進(jìn)新生血管形成，通過旁分泌作用抑制心肌細(xì)胞凋亡或促進(jìn)殘留心肌細(xì)胞再生等因素有關(guān) 。本實驗結(jié)果所顯示的hAD-MSCs對MI的修復(fù)作用是否與其分化成心肌細(xì)胞有關(guān)，分化的心肌細(xì)胞是否參與了心臟的收縮功能，抑或通過旁分泌作用介導(dǎo)抑制心肌細(xì)胞凋亡或促進(jìn)心肌細(xì)胞增生和血管形成，均有待深入研究。

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