應(yīng)用ITS序列對中藥材紅芪進(jìn)行鑒定的有效性分析＊

魏妮娜，王曉明，牛憲立，姬可平

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物化學(xué)與細(xì)胞分子生物學(xué)教研室，廣東珠海 519041)

紅芪(Radix Hedysari)為豆科植物多序巖黃芪(Hedysarum polybotrys)的干燥根，為甘肅省道地中藥材，在甘肅省分布較廣，其中岷縣最為出名［1］。中藥材傳統(tǒng)鑒定技術(shù)多采用新鮮植株材料，鑒定人員需具備一定的植物分類學(xué)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，市面上銷售的紅芪多為加工過的藥材，其表面性狀及顯微特征均已發(fā)生變化，給鑒定工作帶來很大的困難［3］。本文采用ITS序列對中藥材紅芪從分子水平進(jìn)行鑒定，旨在探討ITS條形碼技術(shù)對中藥材鑒定的有效性。

1 材料

1.1 供試材料 供試材料紅芪由通訊作者購買于甘肅省定西地區(qū)岷縣藥材公司，并經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定，憑證標(biāo)本存放于遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物化學(xué)與細(xì)胞分子生物學(xué)教研室。

1.2 試驗(yàn)試劑 三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、醋酸鈉、硼酸，購于天津大茂化學(xué)試劑廠;Tris－飽和酚、氯仿、異戊醇、濃HCl、異丙醇、無水乙醇，購于廣州番禺力強(qiáng)化工廠;瓊脂糖、GoldView TM購于莊萌生物;高保真即用型PCR試劑盒、RNase，購于上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;ITS序列擴(kuò)增引物合成于北京六合華大基因科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器 液氮罐(東亞液氮罐YDS系列)、高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、恒溫水浴箱(北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、DYCP－31DN型瓊脂糖水平電泳儀(北京六一儀器廠)、EDC－810型基因擴(kuò)增儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)、WD－9413B型凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1 總DNA的提取 采用改良的CTAB法提取靶植物的總 DNA［4］。

2.2 PCR擴(kuò)增 采用ITS序列的通用引物P1:5’－ATGTCACCACAAACAGAAAC －3’，P2:5’－TCGCATGTACCTGCAGTAGC－3’。采用引物 P1和引物P2對供試品的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增。在25(l反應(yīng)體系中，含模板 DNA1(l、引物各 1.0(l、ddH2O10(l、2 × PCR Master13(l。擴(kuò)增:92 ℃ 預(yù)變性5 min;92℃變性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。

2.3 測序 用1.0%瓊脂糖凝膠對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物初步鑒定后，將符合測序要求的樣品送往北京六合華大基因科技股份有限公司(廣州分公司)進(jìn)行雙向測序;應(yīng)用CodonCode Aligner軟件將測序峰圖剪切拼接，獲得高質(zhì)量ITS序列。

2.4 登錄GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫 將ITS序列進(jìn)行BLAST相似性搜索，確定是否是該物種的同屬或者同科植物，并將所得序列提交到GeneBank，獲得登錄號(hào)。

2.5 序列對比分析 將樣品的ITS序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中已有的紅芪、黃芪 ITS序列應(yīng)用MEGE5.1進(jìn)行序列對比，計(jì)算遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹。

3 結(jié)果

3.1 測序結(jié)果及序列分析 將雙向測序所得序列峰圖應(yīng)用CodonCode Aligner軟件將測序峰圖剪切拼接，獲得高質(zhì)量ITS序列(見圖1)。

圖1 紅芪ITS堿基序列

將紅芪ITS序列提交到NCBI利用BLAST進(jìn)行相似性搜索，查看前十個(gè)搜索結(jié)果(見表1)。將紅芪ITS序列提交給 NCBI，獲得登錄號(hào)KF032294。

3.2 堿基變異位點(diǎn)分析 將中藥材紅芪的ITS序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫里已有的多序巖黃芪(Hedysarum polybotrys)、太白巖黃芪(Hedysarum vicioides)、錫金巖黃芪(Hedysarum sikkimense)、黃芪(Astragalusmembranaceus)ITS序列應(yīng)用MEGE5.1進(jìn)行序列對比，分析結(jié)果(見圖2)。

表1 Blast相似度搜索結(jié)果

從圖3中可看出，中藥材紅芪與多序巖黃芪、太白巖黃芪的ITS序列之間有5個(gè)變異位點(diǎn)，分別為129位點(diǎn)的A－G變異，157位點(diǎn)G缺失，264位點(diǎn)的A－C、559位點(diǎn)的T－C和676位點(diǎn)T插入。中藥材紅芪與錫金巖黃芪的ITS序列之間有12個(gè)變異位點(diǎn)，而中藥材紅芪與黃芪的ITS序列之間有102個(gè)變異位點(diǎn)。

3.3 遺傳距離分析 將中藥材紅芪、多序巖黃芪、太白巖黃芪、錫金巖黃芪、黃芪的ITS序列進(jìn)行分析，根據(jù)堿基變異位點(diǎn)的情況，應(yīng)用MEGA5.1軟件計(jì)算出物種間的遺傳距離(見表2)。

圖2 ITS序列的變異位點(diǎn)

表2 兩兩樣品之間的遺傳距離

由表3可得出，紅芪、多序巖黃芪與太白巖黃芪這三個(gè)物種的K－2P距離在0.000到0.004之間，紅芪與錫金巖黃芪的K－2P距離為0.018，而紅芪與黃芪的K－2P距離為0.153。

3.4 系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹分析 從基于ITS條形碼序列構(gòu)建的紅芪與其近緣物種的NJ樹(見圖3)可以看出，紅芪、多序巖黃芪與太白巖黃芪聚為一支，后又與同屬植物錫金巖黃芪聚為一支。而黃芪獨(dú)立為一支。從NJ樹圖可以看出紅芪與黃芪能明顯區(qū)分開。

圖3 紅芪與近緣物種ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

據(jù)調(diào)查市面上出售的紅芪價(jià)格高于黃芪，兩者的價(jià)格差異主要是因采挖的方式不同，紅芪生長在灌木叢中，黃芪是人工規(guī)?；N植，但加工后紅芪和黃芪的形狀是相同的。紅芪作為黃芪的近緣植物，在我國西北、西南、港澳臺(tái)及東南亞地區(qū)仍有將紅芪和黃芪互為替代品的使用習(xí)慣，在港澳及東南亞等地更有認(rèn)為紅芪的藥用價(jià)值大于黃芪。

近年來植物DNA條形碼的研究異常火熱，焦點(diǎn)集中在對植物DNA條形碼候選片段的分析篩選實(shí)驗(yàn)和整體評價(jià)。然而這項(xiàng)技術(shù)尚在研究階段，迄今為止，在陸生植物中還沒有找到理想并具通用性的 DNA 條形碼［5－10］。

本實(shí)驗(yàn)提取經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定的中藥材紅芪總DNA，擴(kuò)增ITS序列進(jìn)行雙向測序，以保證ITS序列的完整性;紅芪的ITS序列總長為680bp，CG含量占54.6%。其中ITS1長299bp，CG含量占57.9%;5.8S 長 161bp，CG 含量占 50.4%;ITS2 長220bp，CG含量占58.6%。將紅芪ITS序列提交到NCBI利用BLAST進(jìn)行相似性搜索。查看前十個(gè)搜索結(jié)果(見表1)，結(jié)果顯示與所檢測序列所屬的植物屬于同屬或同科植物，證明測序準(zhǔn)確。中藥材紅芪ITS序列與其NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中已有的多序巖黃芪和同屬植物太白巖黃芪的ITS序列幾乎完全一致，而與近緣物種黃芪變異較大，故ITS序列可有效區(qū)分紅芪與其近緣物種黃芪。因此，ITS條形碼技術(shù)對加工后的中藥材鑒定有效性提供了依據(jù)。

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