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    孵化期注射維生素C對(duì)肉雞生產(chǎn)性能、免疫和抗氧化性能的影響

    2013-09-20 03:05:54李世召支麗慧楊小軍姚軍虎
    關(guān)鍵詞:孵化率種蛋肉雞

    李世召 支麗慧 楊小軍 姚軍虎

    (西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,楊陵 712100)

    免疫力缺乏和大量應(yīng)激的存在是肉雞規(guī)模化養(yǎng)殖的兩大挑戰(zhàn)。免疫力缺乏可使肉雞容易感染各種疾病,造成大量死亡;還會(huì)將更多能量用于維持免疫,影響生產(chǎn)性能。應(yīng)激情況下,肉雞體內(nèi)產(chǎn)生的多余氧自由基會(huì)和細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng),破壞核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)構(gòu),導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。因此,引進(jìn)、推廣優(yōu)良肉雞品種,并通過(guò)最恰當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行營(yíng)養(yǎng)調(diào)控來(lái)提高肉雞的免疫和抗氧化能力顯得尤為重要。維生素C是一種水溶性維生素,具有抗應(yīng)激[2]、抗氧化[3]和提高免疫力[4]等功能,但易氧化的特性使其在飼糧和飲水中直接添加受到限制[5]。而長(zhǎng)久以來(lái),為了使家禽獲得更好的生產(chǎn)性能,研究者也多采用改善飼養(yǎng)或繁殖環(huán)境、優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)配比的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)[6]。近年來(lái)種蛋顯微操作技術(shù)的發(fā)展為家禽營(yíng)養(yǎng)調(diào)控開(kāi)辟了一個(gè)全新的領(lǐng)域——胚蛋注射營(yíng)養(yǎng)(in ovo feeding,IOF)[6-7]。IOF 源于雞胚接種技術(shù),是指將外源營(yíng)養(yǎng)素注射到家禽的胚蛋中[8]。研究表明,IOF 能促進(jìn)家禽的胚胎發(fā)育[9]、能量?jī)?chǔ)備[10]和出雛后的生長(zhǎng)發(fā)育[11]等。薩索(Sasso)肉雞是由法國(guó)SASSO公司專門(mén)選育的有色優(yōu)質(zhì)肉雞,具有肉質(zhì)好、生長(zhǎng)快和抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),在歐洲市場(chǎng)廣受歡迎[12]。于Sasso肉雞種蛋孵化的合適時(shí)期外源注射維生素C可能會(huì)改善其生產(chǎn)性能、免疫和抗氧化性能。因此,本試驗(yàn)旨在探索通過(guò)IOF方式補(bǔ)充維生素C來(lái)提高肉雞生產(chǎn)性能、免疫和抗氧化性能的可行性,以期為后續(xù)研究提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    孵化機(jī):藍(lán)電孵化機(jī)(9TV-3A,北京藍(lán)天蛟電子技術(shù)有限公司)。

    維生素 C 標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma,A5960):C6H8O8,純度≥99.0%。

    種蛋:Sasso肉雞(C44,淺紅羽)種蛋180枚,購(gòu)于西安市高陵祖代雞場(chǎng)。

    1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    本試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。將180枚Sasso肉雞種蛋隨機(jī)分為3個(gè)處理,每個(gè)處理4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)15枚。于種蛋孵化第11天進(jìn)行注射:對(duì)照組每枚種蛋注射0.1 mL生理鹽水,維生素C注射組每枚種蛋分別注射含3和15 mg維生素C的0.1 mL的生理鹽水。孵化21 d出雛后,每重復(fù)選取體重均勻、健康的雛雞10只進(jìn)行飼養(yǎng),飼養(yǎng)期42 d。

    1.3 孵化與飼養(yǎng)管理

    1.3.1 孵化管理

    溫度:前期(1~10 d)控制在38.0~38.2℃,后期(11~18 d)控制在37.8~38.0℃,落盤(pán)(19~21 d)控制在37.5~37.8℃;濕度:45% ~65%;翻蛋:翻蛋周期為 120 min,翻蛋時(shí)間為180 s;孵化前期注意控溫,孵化后期注意通風(fēng)。

    1.3.2 種蛋注射

    注射體積:0.1 mL;注射部位:卵黃囊;維生素C注射液的配制:將維生素C溶解在生理鹽水中,分別配制成30和150 mg/mL的注射液。

    注意事項(xiàng):種蛋孵化第11天進(jìn)行注射,注射前先照蛋,剔除死胚蛋和無(wú)精蛋,同時(shí)確定胚胎在種蛋中的大致位置;注射前用75%酒精在注射點(diǎn)附近擦拭消毒;注射器針頭的長(zhǎng)度和管徑要適宜;1枚種蛋用1枚針頭;注射完用塑膠封口。

    1.3.3 飼養(yǎng)管理

    參照NRC(1994)肉雞營(yíng)養(yǎng)需要配制基礎(chǔ)飼糧(表1)。試驗(yàn)雞采用3層階梯式籠養(yǎng),各重復(fù)均勻分布于雞舍,自由采食和飲水。按常規(guī)程序進(jìn)行雞只免疫和欄舍消毒。整個(gè)飼養(yǎng)階段的飼糧和飲水中不以任何形式添加維生素C。

    1.4 樣品采集與制備

    于肉雞1、21和42日齡時(shí),每重復(fù)挑選與該重復(fù)平均體重相近的肉雞1只,1日齡頸靜脈采血1 mL(肝素鈉抗凝),21和42日齡翅靜脈采血10 mL(肝素鈉抗凝),均3 000 r/min離心10 min,取分離后的血漿分裝于1.5 mL EP管中,-80℃保存,用于生化指標(biāo)的測(cè)定。試驗(yàn)雞采血結(jié)束,頸部放血致死,取脾臟和法氏囊進(jìn)行稱重。

    1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

    1.5.1 生產(chǎn)性能的測(cè)定

    分別于肉雞21和42日齡(之前停飼12 h)按重復(fù)稱體重和剩料量,計(jì)算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

    1.5.2 免疫指標(biāo)的測(cè)定

    1.5.2.1 免疫器官指數(shù)

    1.5.2.2 流式細(xì)胞分析

    分別于肉雞21和42日齡時(shí),每重復(fù)隨機(jī)挑選1只雞,翅靜脈采血,肝素鈉抗凝:用微量取樣器沿管壁取1 mL抗凝血于離心管中,迅速加入低溫保存的磷酸鹽緩沖液(PBS)1 mL,慢慢混勻;將混合液沿管壁緩慢加入到盛有2 mL淋巴細(xì)胞分層液(室溫預(yù)置)的試管中,2 000 r/min離心25 min;吸取中間乳白色淋巴細(xì)胞層于預(yù)冷的離心管中,加適量PBS,混勻,4℃ 下2 000 r/min離心15 min;棄上清,加適量PBS,混勻,4℃ 下2 000 r/min離心10 min;加入PBS 500μL,充分混勻,取200μL混懸液依次加入CD3單抗和CD8單抗10μL,及CD4單抗5μL,充分混勻,低溫避光孵育30 min;加PBS于離心管0.5刻度線處,4℃下1 500 r/min離心5 min,加適量PBS上流式細(xì)胞儀測(cè)定。

    1.5.3 血漿抗氧化性能的測(cè)定

    血漿總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定:Fe3+還原法;谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性測(cè)定:二硫代二硝基苯甲酸比色法;超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定:黃嘌呤氧化酶法;丙二醛(MDA)含量測(cè)定:硫代巴比妥酸(TBA)比色法;試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

    1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

    采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行one-way ANO-VA,用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,以P<0.05為 顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

    表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(as-fed basis) %

    2 結(jié)果與分析

    2.1 孵化期注射維生素C對(duì)種蛋孵化率和肉雞生產(chǎn)性能的影響

    由表2可知,3 mg注射組的種蛋孵化率和肉雞初生重顯著高于其他組(P<0.05),生理鹽水注射組和15 mg注射組的種蛋孵化率和肉雞初生重均差異不顯著(P>0.05)。

    孵化期注射維生素C對(duì)1~21日齡肉雞的ADFI無(wú)顯著影響(P>0.05),但3 mg注射組22~42日齡和1~42日齡肉雞的ADFI顯著提高(P<0.05)。各組22~42日齡和1~42日齡肉雞的ADG均差異不顯著(P>0.05),但3 mg注射組1~21日齡肉雞的ADG顯著低于生理鹽水注射組(P<0.05)。與生理鹽水注射組相比,3 mg注射組1~21日齡肉雞的F/G顯著提高(P<0.05),且3 mg注射組1~42日齡肉雞的F/G顯著高于其他組(P<0.05)。

    表2 孵化期第11天注射維生素C對(duì)種蛋孵化率和肉雞生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effects of vitamin C injection at 11 days of incubation period on hatchability and performance of broilers

    2.2 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞免疫性能的影響

    由表3可知,與生理鹽水注射組相比,孵化期注射3和15 mg維生素C使肉雞脾臟指數(shù)在21日齡分別降低了19.0%和18.4%,在42日齡分別降低了13.6%和12.6%;法氏囊指數(shù)在21日齡分別降低了31.2%和30.9%,在42日齡分別降低了27.6%和26.2%,但方差分析均差異不顯著(P>0.05)。

    表3 孵化期第11天注射維生素C對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響Table 3 Effects of vitamin C injection at 11 days of incubation period on immune organ indexes of broilers %

    由表4可知,各組肉雞21和42日齡外周血CD3+CD4+比例、CD3+CD8+比例和 CD3+CD4+/CD3+CD8+均差異不顯著(P>0.05)。

    2.3 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞抗氧化性能的影響

    由表5可知,15 mg注射組肉雞21日齡血漿T-AOC顯著高于3 mg注射組(P<0.05),42日齡各組血漿T-AOC差異不顯著(P>0.05)。各組21日齡肉雞血漿GSH-Px和SOD活性差異不顯著(P>0.05),但15 mg注射組42日齡肉雞血漿GSH-Px和SOD活性顯著高于生理鹽水注射組和3 mg注射組(P<0.05)。各組21和42日齡肉雞血漿MDA含量均差異不顯著(P>0.05)。

    表4 孵化期第11天注射維生素C對(duì)肉雞外周血T淋巴細(xì)胞亞型比例的影響Table 4 Effects of vitamin C injection at 11 days of incubation period on lymphocyte subset of peripheral blood T lymphocyte of broilers

    表5 孵化期第11天注射維生素C對(duì)肉雞抗氧化性能的影響Table 5 Effects of vitamin C injection at 11 days of incubation period on antioxidant function of broilers

    3 討論

    3.1 孵化期注射維生素C對(duì)種蛋孵化率和肉雞生產(chǎn)性能的影響

    3.1.1 孵化期注射維生素C對(duì)種蛋孵化率的影響

    對(duì)于孵化場(chǎng)而言,種蛋孵化率提高意味著經(jīng)濟(jì)效益提高,而種蛋中注射營(yíng)養(yǎng)素可提高孵化率[13-14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,種蛋中注射3 mg維生素C時(shí)可顯著提高孵化率(P<0.05)。Elíbol等[15]的研究同樣表明,種蛋孵化第13天注射3 mg的維生素C能顯著降低孵化后期的胚胎死亡率(P<0.05)。新生卵中不存在維生素C,當(dāng)胚胎發(fā)育至第3~4天時(shí),可內(nèi)源性合成,但在人工孵化條件下,合成的數(shù)量不能滿足發(fā)育需求[6]。尤其到孵化后期,過(guò)量代謝熱的產(chǎn)生會(huì)影響胚胎發(fā)育[16],此時(shí)添加維生素 C可有效緩解這種壓力[17]。這是因?yàn)榫S生素C可調(diào)節(jié)腎上腺激素對(duì)21-羥化酶和β-羥化酶的抑制作用,利于腎上腺酮產(chǎn)生,促進(jìn)糖異生,使胚胎有足夠的能量來(lái)適應(yīng)胚胎發(fā)育后期孵化環(huán)境的改變[16]。數(shù)據(jù)表明,白萊航雞種蛋孵化至第15天時(shí),血漿中維生素C的含量開(kāi)始顯著降低(P<0.05)[18],而當(dāng)胚胎發(fā)育到第10天以后,因代謝熱增加可提高胚胎死亡率[16]。但維生素C濃度并非越高越好,若血液中腎上腺酮的含量長(zhǎng)時(shí)間維持在較高水平,會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性,損害機(jī)體健康而降低孵化率[16]。增加維生素C的濃度會(huì)伴隨著對(duì)胰島β細(xì)胞毒性的增加[19];種蛋孵化前注射750 mg/mL的維生素C對(duì)胚胎是有毒性的[20]。因此本研究中,當(dāng)維生素C的注射量為15 mg時(shí)并未顯著提高種蛋的孵化率(P>0.05),可能與高濃度維生素C對(duì)胚胎發(fā)育的毒性有關(guān)。

    3.1.2 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

    與種蛋孵化率的結(jié)果相似,當(dāng)維生素C的注射劑量為3 mg時(shí),肉雞的初生重顯著高于其他組(P<0.05),這可能是因?yàn)榫S生素C在緩解胚胎發(fā)育后期熱應(yīng)激的同時(shí),促進(jìn)了胚胎發(fā)育。增加維生素C注射劑量并未得到更加積極的作用,則系因高劑量維生素C對(duì)胚胎細(xì)胞存在一定的毒副作用[16,19]。

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,孵化期注射3 mg維生素C可一定程度上提高Sasso肉雞生長(zhǎng)后期(22~42日齡)的ADG和ADFI,但同時(shí)提高了F/G。這除了因孵化期注射3 mg維生素C促進(jìn)了胚胎發(fā)育,提高了肉雞初生重外,還可能與本試驗(yàn)所選取的肉雞品種有關(guān)。

    3.2 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞免疫性能的影響

    3.2.1 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

    免疫器官稱重法是研究機(jī)體免疫體況的方法之一。一般認(rèn)為免疫器官相對(duì)重量降低為免疫抑制所致,而免疫器官相對(duì)重量增加則為免疫增強(qiáng)的表現(xiàn)[21]。法氏囊和脾臟是家禽重要的免疫器官,其中法氏囊屬于中樞免疫器官,是血清抗體生成系統(tǒng)的細(xì)胞成長(zhǎng)和分化部分,對(duì)雛雞的免疫能力有較大的決定作用;脾臟屬于外周免疫器官,能產(chǎn)生淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞,分泌特殊抗體[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,孵化期注射3和15 mg維生素C后,21和42日齡的脾臟指數(shù)分別降低了19.0%、18.4%和13.6%、12.6%,法氏囊指數(shù)分別降低了31.2%、30.9%和27.6%、26.2%,但方差分析均差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明孵化期注射維生素C可能會(huì)抑制肉雞免疫器官發(fā)育。研究表明,雞脾臟在胚胎發(fā)育至12胚齡時(shí)初具輪廓,隨后開(kāi)始快速發(fā)育[22];對(duì)雞法氏囊功能發(fā)揮有重要作用的黏膜皺襞從孵化期第11~12天開(kāi)始形成[23]。而本試驗(yàn)選取的注射時(shí)間是11胚齡(孵化期第11天),免疫器官發(fā)育處在關(guān)鍵時(shí)期,可能因注射帶來(lái)的外源刺激而受到影響。另外,孵化期注射維生素C促進(jìn)胚胎在發(fā)育后期利用更多的能量來(lái)緩解熱應(yīng)激,也可能是影響免疫等器官發(fā)育的原因之一。

    3.2.2 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞外周血T淋巴細(xì)胞亞型的影響

    機(jī)體外周血淋巴細(xì)胞的數(shù)量及T淋巴細(xì)胞不同亞型的分布與機(jī)體的免疫狀態(tài)直接相關(guān)[24]。正常情況下,機(jī)體T淋巴細(xì)胞各亞型的數(shù)量和比例相對(duì)穩(wěn)定,它們共同使機(jī)體在遭受外來(lái)抗原刺激時(shí)產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答,維持機(jī)體免疫狀態(tài)平衡[25]。特別是外周血中參與對(duì)外源性抗原識(shí)別的CD4+T淋巴細(xì)胞、內(nèi)源性抗原識(shí)別的CD8+T淋巴細(xì)胞水平及兩者比值(CD4+/CD8+)是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)[24]。

    維生素C與免疫系統(tǒng)之間存在明顯交互作用[26]。研究表明,維生素C有助于免疫細(xì)胞免受免疫反應(yīng)時(shí)釋放的酶、酸和氧化物等構(gòu)成的自噬機(jī)制的影響,因此保持細(xì)胞內(nèi)較高的維生素C水平,可使免疫細(xì)胞在遭受病原體侵害時(shí)發(fā)揮更持久的作用[27]。但 McCorkle 等[28]指出細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答不因添加維生素C而受到影響。本試驗(yàn)中,孵化期注射不同水平的維生素C對(duì)肉雞外周血T淋巴細(xì)胞亞型沒(méi)有影響(P>0.05),說(shuō)明維生素C不參與T淋巴細(xì)胞亞型分化。McCorkle等[28]同樣認(rèn)為,維生素C可參與 B淋巴細(xì)胞分化,但對(duì)T淋巴細(xì)胞的分化無(wú)調(diào)節(jié)作用。

    3.3 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞抗氧化性能的影響

    肉雞因代謝、生長(zhǎng)發(fā)育快,易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),產(chǎn)生對(duì)機(jī)體有害的過(guò)氧化產(chǎn)物[21]。維生素C作為一種抗氧化劑,在細(xì)胞外液中通過(guò)中和機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基(O-2·)和羥基自由基(·OH)等自由基及其氧化物,來(lái)保護(hù)生物膜免受脂質(zhì)過(guò)氧化的破壞[29]。

    血液和組織的T-AOC、SOD和GSH-Px活性及MDA含量是反映機(jī)體抗氧化性能的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,與生理鹽水注射組和3 mg注射組相比,孵化期注射15 mg維生素C可顯著提高肉雞42日齡血漿GSH-Px和SOD活性(P<0.05),且15 mg注射組21日齡肉雞血漿T-AOC顯著高于3 mg注射組(P<0.05),但與生理鹽水注射組差異不顯著(P>0.05)。這說(shuō)明孵化期注射15 mg維生素C可在一定程度上提高肉雞的抗氧化性能,這與飼糧中添加維生素C的效果相似。但哪種方式對(duì)抗氧化性能的提高更為突出,需進(jìn)一步研究。

    4 結(jié)論

    ①孵化期注射3 mg維生素C可提高肉雞的孵化率、初生重和1~42日齡ADFI,但提高了1~42日齡F/G。

    ②孵化期注射15 mg維生素C可在一定程度上提高肉雞的抗氧化性能。

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