大鼠Sertoli細胞對骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化的影響

應涵汝 蔣黎華 王韋侖 李偉毅

骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）是具有多向分化潛能的成體干細胞[1]，在特定誘導環(huán)境下可向多種細胞分化，因而成為多種器官、組織移植的研究熱點[2]。怎樣促進BMSCs的分化、減少其移植排斥、增強其免疫抑制作用和降低其不良轉(zhuǎn)化的風險，是其有效臨床應用需要解決的問題。睪丸支持細胞（Sertoli cells,SCs）具有免疫負調(diào)功能，與移植物共同移植可延長同種異體移植物在體內(nèi)的存活時間[3]。SCs能夠分泌多種物質(zhì)，可促進其他細胞的增殖與分化[4]。本研究將兩者共同培養(yǎng)，觀察SCs對BMSCs誘導分化的影響，以期為BMSCs的誘導分化和移植提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

18～22 d雄性SD大鼠、6周SD大鼠（上海交大醫(yī)學院動科部）；細胞培養(yǎng)液LG-DMEM、DMEM/F12（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；透明質(zhì)酸酶、膠原酶Ⅱ、DNA酶、0.25%胰蛋白酶-EDTA（Sigma 公司）； Percoll（Pharmacia 公司）；吲哚美辛、抗壞血酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、地塞米松、β-甘油磷酸二鈉鹽 （Sigma公司）；β-巰基乙醇、甘油（Amresco公司）；油紅、茜素紅（北京索萊寶公司）；細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶（Coning公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 BMSCs分離及傳代培養(yǎng)

根據(jù)鼠齡對BMSCs生長和分化潛能影響的研究結(jié)果[5]，選用6周齡SD大鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉，無菌條件下取雙側(cè)股骨和脛骨，生理鹽水沖洗后剪開兩端骨骺，用LG-DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔直至骨髓腔發(fā)白。吹打沖洗液，制成均勻的細胞懸液，將細胞懸液滴加至密度為1.077的Percoll分離液上，2 000 r/min離心20 min，收集界面層云霧狀單個核細胞層，LG-DMEM 液 1 000 r/min、5 min，洗滌 1 次，生長培養(yǎng)基（LG-DMEM、12%FBS）重懸，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后首次全量換液，去除未貼壁細胞，之后每3～4天半量換液。當細胞細胞融合達80%以上時，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。

1.2.2 SCs的分離培養(yǎng)

取18～22 d雄性SD大鼠睪丸，生理鹽水沖洗后剝除白膜，扒松睪丸實質(zhì)。加入5 mL酶混合液（1.5 mg/mL透明質(zhì)酸酶、3 mg/mL膠原酶Ⅱ、1.5 mg/mL DNase），37℃水浴振搖消化45 min。加入DMEM/F12 10 mL混勻，靜置5 min后棄去液體，再次加入培養(yǎng)液混勻靜置5 min后棄液體。再加入5 mL酶混合液，室溫下吹打10 min，至鏡下觀察為單細胞和小細胞團時，加入10 mL DMEM/F12混勻，靜置 5 min，吸去上層50%液體，低滲處理去除生精細胞，200目篩網(wǎng)過濾，DMEM/F12 洗 2 次，1 000 r/min、8 min。

1.2.3 BMSCs的誘導分化及SCs對其分化的影響

1.2.3.1 成骨細胞方向誘導

取第3代SD大鼠BMSCs，用含12%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基以8×104cells/cm2密度，重新接種于明膠溶液預處理的96孔板內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后吸棄生長培養(yǎng)液，加入200 μL成骨分化培養(yǎng)基（LG-DMEM、10%FBS、抗壞血酸 50mg/L、β-甘油10 mmol/L、地塞米松10 mmol/L）。每3天全量換液。2～3周后觀察細胞形態(tài)，茜素紅S染色鑒定。

1.2.3.2 成脂方向誘導

取第 4代 BMSCs，96孔板內(nèi)以 8×104cells/cm2密度，重新接種細胞，每孔中加入200 μL生長培養(yǎng)基。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3天半量換液，細胞達100%融合3～5 d后誘導成脂分化。吸棄生長培養(yǎng)液，加入200 μL成脂誘導培養(yǎng)基（LG-DMEM、10%FBS、 胰島素10mg/L、IBMX0.5mmol/L、 吲哚美辛0.2 mmol/L、地塞米松 l μmol/L）。誘導 3 d后，維持培養(yǎng)基（LG-DMEM、10%FBS、胰島素 10 mg/L）全量換液。24 h后，將培養(yǎng)基再全量替換為誘導培養(yǎng)基。重復誘導/維持的周期3次，后用維持培養(yǎng)基再培養(yǎng)細胞7 d，每3天更換培養(yǎng)基。鏡下觀察BMSCs細胞的形態(tài)變化，油紅O染色鑒定。

1.2.3.3 成神經(jīng)方向誘導

取第 4代 BMSCs，96孔板內(nèi)以 8×104cells/cm2密度重新接種細胞，并在每孔中加入200 μL生長培養(yǎng)基。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3天半量換液，直至細胞達70%～80%融合后，再進行成神經(jīng)誘導。小心吸去每孔中的培養(yǎng)基，加入200 μL誘導培養(yǎng)基 （LG-DMEM、20%FBS、5 mmol/L 2-巰基乙醇）誘導培養(yǎng)24 h后，鏡下觀察BMSCs的形態(tài)變化。

1.2.3.4 SCs對間充質(zhì)干細胞誘導分化的影響

上述BMSCs誘導分化體系中均以2×105個/孔的濃度加入SCs，觀察其對BMSCs誘導分化的影響。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs的成脂誘導分化及SCs對其影響

BMSCs經(jīng)成脂誘導后，低倍鏡下仍可見梭形或多角形的細胞形態(tài)，但與正常培養(yǎng)狀態(tài)相比，體積縮小并呈扁圓形或紡錘形；高倍鏡下見細胞質(zhì)內(nèi)已形成細小而亮的小脂滴，提示成脂誘導分化；加入SCs后，低倍鏡下可見細胞外形明顯改變，細胞間出現(xiàn)大量大小不一的空泡，無法觀察到BMSCs的清晰邊界，共同培養(yǎng)體系整體呈現(xiàn)蜂窩狀，高倍鏡下亦難見細胞的清晰邊界，但可觀察到散布少量細小而亮的微小脂滴。油紅O染色顯示，加入SCs的BMSCs紅染細胞及細胞內(nèi)的脂滴均較之前明顯減少（圖1）。

2.2 大鼠BMSCs的成骨誘導分化及SCs對其影響

BMSCs經(jīng)成骨誘導后，胞體較狹長，細胞間排列整齊，部分區(qū)域細胞呈多角形并聚集成集落；加入SCs后，由于細胞疊加，不能清晰觀察到細胞的形態(tài)。茜素紅S染色顯示，BMSCs誘導后見少量鈣結(jié)節(jié)，染色點較?。患尤隨Cs后則可見較多鈣結(jié)節(jié)，紅染明顯較大，提示SCs對成骨誘導有促進作用（圖2）。

圖1 BMSCs形態(tài)學觀察Fig.1 Morphological observation of BMSCs

圖2 BMSCs成骨誘導分化Fig.2BMSCs

2.3 大鼠BMSCs成神經(jīng)誘導分化及SCs對其影響

成神經(jīng)誘導分化培養(yǎng)基誘導24 h后，大部分的BMSCs胞質(zhì)收縮、變小，呈不規(guī)則形、多角形、小圓形等形態(tài)，并逐漸形成突起。部分細胞形成明顯的神經(jīng)細胞樣形態(tài)，細胞體呈圓形，突起較長，雙極或多極形，在突起末端出現(xiàn)分支，部分相鄰細胞的突起可連接成網(wǎng)，胞漿內(nèi)有折光性較強的細小顆粒。加入SCs后，BMSCs的形態(tài)學表現(xiàn)無明顯改變。

3 討論

BMSCs是中胚層來源的具有多向分化潛能的成體干細胞，可在體外被誘導向骨、軟骨、心肌、脂肪和肌腱等細胞分化，還能跨胚層向上皮細胞、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞等方向分化，具有非常廣闊的應用前景[1-2，6-8]。目前，用于誘導MSCs分化的試劑主要是化學分子和細胞因子，未能模擬最佳的生理分化環(huán)境，存在分化不足和潛在致瘤風險等問題。另外，MSCs雖然存在于骨髓、外周血、脂肪、胎盤、臍帶等多種組織中，但含量很低，必須體外擴增，才能獲得足夠臨床應用數(shù)量級的種子細胞。而長時間培養(yǎng)和分化失敗，都會增加MSCs惡性轉(zhuǎn)化的幾率[9-11]。

SCs為睪丸發(fā)育和生精微環(huán)境平衡的主要維持者，具有促進生精細胞分化發(fā)育和誘導生精細胞凋亡的雙重調(diào)控作用。SCs值得關注的兩大功能是：①可通過主動的免疫負調(diào)作用形成睪丸的免疫豁免，而這一特性使其在器官移植后免疫耐受的建立方面展現(xiàn)很大的應用前景；②SCs能分泌多種物質(zhì)，包括轉(zhuǎn)運蛋白、調(diào)節(jié)蛋白、生長因子在內(nèi)的多種細胞因子及類固醇類等，實驗證實，SCs能夠幫助多種細胞，如神經(jīng)干細胞、胰島細胞等的存活與分化[3-4，12-13]。

基于BMSCs和SCs的生物學特性及其在移植免疫耐受建立中的應用前景，本研究觀察了SCs對BMSCs誘導分化的影響。結(jié)果顯示，在BMSCs成骨誘導分化的培養(yǎng)體系中引入SCs，可使成骨誘導更為迅速，提示SCs所分泌的物質(zhì)可輔助BMSCs的成骨誘導。基于目前研究所顯示的SCs與其他細胞共同移植可抑制移植排斥的特點，BMSCs與SCs共培養(yǎng)可為異體移植修復骨組織提供新的思路。而SCs本身是否對BMSCs具有定向誘導作用、通過何種機制輔助BMSC的成骨誘導等問題仍需進一步研究。同時，在本研究中顯示的BMSCs成脂誘導可被SCs所抑制，其機制同樣值得進行深入的探討。

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