反義內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶核酸表達(dá)質(zhì)粒納米粒所致內(nèi)皮素的減少對(duì)哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性的影響

周雨田，徐 軍

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院干部科老年疾病研究所呼吸病房，四川 成都 610072;2.廣州醫(yī)學(xué)院廣州呼吸疾病研究所國家重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣東 廣州510120)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性變態(tài)反應(yīng)性疾病，以氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsivenes，AHR)為特點(diǎn)。過量表達(dá)的炎癥因子內(nèi)皮素(endothelin-1，ET-1)在引起哮喘變應(yīng)性氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的過程中起著重要的作用[1]，最終導(dǎo)致肺功能的損害。我們既往的研究提示12-烷基化殼聚糖納米粒(12-ACSs)包裹的反義ECE核酸納米載體能夠成功地在體外氣道上皮細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)核酸，發(fā)揮RNA干擾效應(yīng)，減少變應(yīng)原誘導(dǎo)的ET-1的過度生成[2]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討經(jīng)過12-烷基化殼聚糖納米粒(12-ACSs)包裹的反義內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶(ECE)核酸表達(dá)質(zhì)粒治療后，在炎癥因子內(nèi)皮素減少的情況下，能否對(duì)哮喘模型小鼠肺功能構(gòu)成影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性Balb/c小鼠數(shù)量40只，6～8周齡，體重18～22 g，SPF級(jí)，購自中山醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房。

1.2 主要試劑和儀器 12-ACSs由天津大學(xué)材料學(xué)院劉文廣教授惠贈(zèng)。小鼠 IL-13和IFN-γELISA試劑盒(比利時(shí) Biosource公司)，小鼠 Endothelin(ET)ELISA試劑盒(美國Cayman公司)，小鼠IL-4 ELISA試劑盒(比利時(shí)Biosource公司)，酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystem公司)。pEGFPN2－反義ECE表達(dá)質(zhì)粒(本研究所構(gòu)建)，OVA購自美國Sigma公司，辣根過氧化物酶(HRP)藕聯(lián)的羊抗鼠抗體(二抗IgG)、HRP藕聯(lián)的抗生物素抗體購自美國Oncogene公司，乙酰甲膽堿(methacholine，Mch)購自Sigma公司，美國Buxco小鼠肺功能儀。

1.3 12-ACSs的制備 將烷基化殼聚糖與pEGFPN2-反義ECE表達(dá)質(zhì)粒按質(zhì)量比2∶1制備包裹反義ECE核酸的12-ACSs納米粒。0.4μm孔徑濾器過濾除菌。

1.4 變應(yīng)性氣道炎癥模型的建立和處理 將40只小鼠按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分為4組，每組10只。N組僅給予生理鹽水致敏、激發(fā)并治療;NM組予OVA致敏、激發(fā)并給予包裹反義ECE核酸的12-ACSs治療;AS組為OVA致敏、激發(fā)后給予生理鹽水治療的氣道炎癥模型組;DNA組為OVA致敏、激發(fā)并給予裸反義ECE核酸治療組。NM組、As組、DNA組于于第0天與第14天每只小鼠分別腹腔注射OVA致敏液0.2 m1，于第 24、25、26 天，以 1%OVA 溶液 8 m l霧化吸入，35 min/(次·天)。N組分別給予相同體積的生理鹽水腹腔注射及霧化吸入。NM組、As組和DNA組于首次激發(fā)前24小時(shí)分別通過氣道灌注包裹反義ECE核酸的12-ACSs(含反義ECE核酸5 μg)100 μl、0.9%生理鹽水 100 μl和反義ECE 核酸5μg加 0.9%生理鹽水(總量 100μl)，N組用等體積0.9%生理鹽水處理。

1.5 支氣管肺泡灌洗 小鼠分組及處理同前，小鼠摘眼球放血后處死，氣管插管，肺泡灌洗PBS 0.8ml×3次。灌洗液離心1500 r/min×10min，細(xì)胞沉淀制備細(xì)胞涂片。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.6 肺組織病理檢查 小鼠分組及處理同前，小鼠摘眼球放血后頸椎脫臼處死，開胸取右肺組織，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、制備石蠟切片、HE染色。

1.7 ELISA法檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子小鼠分組及處理同前，無菌分離脾細(xì)胞，以MEM完全培養(yǎng)基調(diào)整脾細(xì)胞濃度至2×106/ml，以1 ml/孔體積接種于24孔板，加OVA(終濃度500 mg/L)刺激的條件下，于37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)72 h，離心收取培養(yǎng)液上清液，－20℃保存待測。

1.8 增強(qiáng)呼氣間歇(enhanced pause，Penh)的檢測末次激發(fā)后48 h，用Buxco小鼠無創(chuàng)肺功能儀檢測小鼠的Penh的變化，設(shè)定Mch激發(fā)濃度依次為0、3.12、6.25、12.5、25 和 50 g/L，記錄 Penh 平均值。以生理鹽水刺激時(shí)的Penh為基值，將各Penh的與生理鹽水激發(fā)時(shí)的Penh值的百分比(Penh/NS%)作為氣道反應(yīng)性統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，以Penh%表示，作為小鼠氣道反應(yīng)性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0軟件。對(duì)各組數(shù)據(jù)(以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示)先進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和單因素方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)采用LSD法行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢查 與N組相比，As組、DNA組和NM組細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比與絕對(duì)計(jì)數(shù)均增高。而治療后NM組上述三種指標(biāo)均顯著低于As組和DNA組小鼠，見表1。

表1 各組支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及所占比例

2.2 小鼠肺病理改變 As和DNA組小鼠支氣管、細(xì)支氣管上皮下和小血管可見嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，氣道上皮結(jié)構(gòu)紊亂，部分脫落，管腔內(nèi)滲出增加，上皮下充血水腫明顯，亦可見炎性細(xì)胞浸潤。N組小鼠與其他3組比較，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，纖毛上皮整齊，無炎性細(xì)胞的浸潤及充血水腫。NM組肺部炎癥改變較As組和DNA組有所減輕(圖1)。

圖1 肺病理改變(HE染色，400×)a.N 組，b.As組，c.NM 組，d.DNA 組

2.3 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子檢測結(jié)果 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液N組ET水平均明顯低于NM組、As組和DNA組(均P＜0.001)，而NM組ET水平則明顯低于As組和DNA組(均P＜0.001)，As組和DNA組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.051)，IL-4結(jié)果與ET相似，見表2。

表2 各組小鼠脾細(xì)胞OVA刺激培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子的含量 (ng/L)

2.4 各組小鼠氣道反應(yīng)性 在各濃度MCh激發(fā)下，As、NM、DNA組較N組小鼠氣道氣道反應(yīng)性明顯增高，而NM組氣道阻力較As及DNA組明顯降低(圖2)。

圖2 各組小鼠氣道功能

3 討論

在既往的研究中，我們制備的12-ACSs包裹的pEGFPN2-反義ECE表達(dá)質(zhì)粒納米粒通過活體動(dòng)物氣道滴注，顯示其可以成功地在活體動(dòng)物表達(dá)，減少ET的生成[3]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，其余各組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ET水平均顯著升高，而NM組小鼠肺勻漿上清中，ET水平明顯低于 As和DNA組，表明12-ACSs包裹的反義ECE質(zhì)粒能夠成功在小鼠氣道表達(dá)，減少了內(nèi)皮素的生成，國外有研究發(fā)現(xiàn)ET有促進(jìn)IL-4，IL-5和IL-13分泌的作用，使用ET受體拮抗劑可以阻斷該作用[4]，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子IL-4的水平亦相應(yīng)明顯下降。作為Th2亞群的代表性細(xì)胞因子，IL-4能刺激B細(xì)胞的增殖和分化以及合成和分泌IgE，促進(jìn)肥大細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的粘附和嗜酸粒細(xì)胞的趨化。它還能促進(jìn)粘蛋白的基因表達(dá)和杯狀細(xì)胞化生。此外，IL-4還是T細(xì)胞自身分泌的生長因子，能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th2型分化，誘導(dǎo)哮喘的發(fā)生[5]。從上述研究結(jié)果可以看出：通過12-ACSs包裹的pEGFPN2-反義ECE表達(dá)質(zhì)粒納米粒的治療，減少了ET及IL-4這些炎癥細(xì)胞因子的生成，從而達(dá)到減輕哮喘氣道炎癥的目的。

在上述結(jié)果基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步研究該納米粒是否能對(duì)減輕哮喘的氣道高反應(yīng)性。支氣管哮喘作為一種慢性氣道炎癥性疾病，氣道高反應(yīng)性是哮喘患者產(chǎn)生癥狀的主要原因。本實(shí)驗(yàn)12-ACSs包裹的pEGFPN2-反義ECE表達(dá)質(zhì)粒納米粒治療后發(fā)現(xiàn)其對(duì)小鼠支氣管哮喘的發(fā)生具有明顯的保護(hù)作用。內(nèi)皮素減少后可明顯降低支氣管灌洗液中細(xì)胞數(shù)，降低脾細(xì)胞培養(yǎng)液中內(nèi)皮素、IL-4水平，病理切片也說明12-ACSs包裹的pEGFPN2－反義ECE表達(dá)質(zhì)粒納米?？梢詼p少炎癥細(xì)胞的浸潤，減少氣道分泌物的滲出，從而降低氣道炎癥，由此我們推測氣道炎癥降低后可緩解氣道高反應(yīng)性，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)：NM組的氣道高反應(yīng)性明顯低于As組和DNA組。氣道高反應(yīng)性是哮喘的特征性表現(xiàn)，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全清楚，但已有的研究表明氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥密切相關(guān)[6]。本研究的結(jié)果提示由于反義ECE質(zhì)粒納米粒導(dǎo)致的ET的生成減少，可以減輕哮喘氣道炎癥及相關(guān)的氣道高反應(yīng)性。

綜上所述，給予哮喘模型小鼠氣道內(nèi)添加12-ACSs包裹的反義ECE質(zhì)粒納米粒治療，可以減少ET、IL-4等炎癥介質(zhì)的生成，抑制炎癥細(xì)胞在氣道的聚集，繼而達(dá)到減輕氣道高反應(yīng)性的目的，因此，12-ACSs包裹的反義ECE質(zhì)粒治療方法有可能發(fā)展成為支氣管哮喘新的治療策略。

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