熒光定量PCR檢測HCV核酸提取法臨床價(jià)值分析

張為民 龔文波

丙肝是因感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)引起的病毒性肝炎，主要是通過母嬰、血液和體液傳播［1］。丙肝病理機(jī)制主要為免疫病理損害，因其易發(fā)展為肝硬化或肝癌，臨床對此疾病重視程度很高。HCV屬黃病毒科，擁有單股正鏈RNA［2］，臨床上主要以HCV RNA含量作為丙肝的確診實(shí)驗(yàn)，而常選用的丙型肝炎病毒RNA熒光定量檢測試劑盒中上核酸的提取方法通常有兩種，即氯仿-異丙醇法和核酸分離柱法。現(xiàn)對兩種核酸提取法結(jié)果和重復(fù)性進(jìn)行對比，其結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本來源為本院2011年3月至2012年6月間肝炎門診初步診斷為丙型肝炎患者血清120份。其中男性65人，女性55人。男性平均年齡為(56.2±2.1)歲，女性平均年齡為(55.1±1.9)歲。血清標(biāo)本內(nèi)部差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 儀器與試劑 Roche公司LightCycler熒光定量PCR分析儀。氯仿-異丙醇法和核酸分離柱法提取試劑及擴(kuò)增試劑均購自凱杰生物工程(深圳)有限公司，試劑盒最低檢測限為5.0×1012IU/mL。檢測抗-HCV采用第三代ELISA抗-HCV試劑盒。

1.3 方法 分別按試劑盒的說明書進(jìn)行RNA提取，然后再使用儀器對其擴(kuò)增，分析提取效率。重復(fù)性檢測:取上述中等含量的HCV RNA血清標(biāo)本1份，分別用上述兩種方法各提取核酸8次，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，定量結(jié)果計(jì)算對數(shù)值比較兩種方法提取的重復(fù)性。

1.4 質(zhì)量控制 每次檢驗(yàn)都必須做室內(nèi)質(zhì)控，必須在質(zhì)控范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才可靠，才有研究價(jià)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種核酸提取法提取RNA效率比較 兩種核酸提取法均以HCV RNA≥1.0×103copies/ml為HCV RNA為陽性標(biāo)本，兩種方法比較結(jié)果如表1所示。氯仿-異丙醇法提取RNA陽性率為78.3%，而核酸分離柱法提取 RNA陽性率為81.7%。χ2=0.42，P＞0.05。兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見兩種方法提取RNA的效率接近(核酸分離柱法稍好一點(diǎn))，都可以較好地提取RNA。

表1 120份標(biāo)本兩種核酸提取法HCV RNA結(jié)果對比(n)

2.2 抗-HCV與HCV RNA結(jié)果比較 如表2所示。兩種方法的HCV RNA與抗-HCV檢出率比較，χ2=18.44，P＜0.05(氯仿-異丙醇法);χ2=13.98，P ＜0.05(核酸分離柱法);兩種方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2120份標(biāo)本抗-HCV與HCV RNA結(jié)果比較(n，%)

2.3 重復(fù)性對比 取中等含量的HCV RNA標(biāo)本1份，分別用兩種方法各提取核酸8次，提取完成后進(jìn)行熒光定量PCR檢測，定量結(jié)果的對數(shù)值分別如表3所示，兩種方法的變異系數(shù)差異顯著，即核酸分離柱法的重復(fù)性好于氯仿-異丙醇法。

表3 兩種核酸提取法的重復(fù)性對比(n，%)

3 討論

丙肝是因感染丙型肝炎病毒(HCV)引起的病毒性肝炎，傳播途徑主要有母嬰傳播、血液傳播以及體液傳播。丙型肝炎全球都有流行，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，每年新發(fā)丙型肝炎病例就有3.5萬例［3］。感染HCV可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌(HCC)。研究顯示，未來20年內(nèi)與HCV感染相關(guān)的死亡率將繼續(xù)增加，對患者的健康和生命危害極大，因此丙型肝炎已成為嚴(yán)重的社會(huì)和公共衛(wèi)生問題［4］。

在丙型肝炎的診治上，建立針對HCV的高靈敏度、特異性和穩(wěn)定性的檢測方法具有重要意義，若能早期診斷并治療，對疾病的預(yù)后也有正面影響。熒光定量PCR(RQ-PCR)是是1996年由美國ABI公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)［5］，它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度。目前RQ-PCR檢測HCV RNA在臨床已廣泛應(yīng)用，RQ-PCR技術(shù)融合了PCR技術(shù)與DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過程只在加樣時(shí)打開1次反應(yīng)管，在PCR的每個(gè)循環(huán)中可以直接監(jiān)測到熒光信號(hào)的變化，根據(jù)PCR反應(yīng)酶動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，分析軟件會(huì)自動(dòng)對DNA進(jìn)行定量，因此也有人稱RQ-PCR為實(shí)時(shí)熒光定量PCR［6］(real-time quantitative PCR)。其優(yōu)點(diǎn)較多，敏感、特異、快速、無污染等都是其優(yōu)勢之處。但是熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)要求較高，即對采用的樣品、試劑都需達(dá)到一定的標(biāo)準(zhǔn)才能完成成功檢測。其中將核酸提取出來，作為熒光定量PCR反應(yīng)的模板，這一步相當(dāng)重要。模板的差異可直接影響PCR擴(kuò)增效果與HCV RNA的檢測結(jié)果。

本文通過比較兩種核酸提取方法的提取效率與重復(fù)性，來為臨床選擇更好的核酸提取方法，以提高臨床上對于HCV診斷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，120份血清標(biāo)本中氯仿-異丙醇法的核酸提取效率為78.3%(陽性例數(shù)為94例)，核酸分離柱法的提取效率為81.7%(陽性例數(shù)為98例);兩者提取效率相近(核酸分離柱法稍好一點(diǎn))，都基本可以滿足臨床的需要，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在抗-HCV抗體與HCV RNA結(jié)果比較中，抗-HCV抗體陽性率顯著高于HCV RNA檢出率(P＜0.05)，其原因可能是試劑盒因素導(dǎo)致抗-HCV抗體假陽性抑或大多數(shù)患者使用的干擾素抗病毒治療，干擾和抑制了病毒的復(fù)制，卻不影響其抗體的存在;因此可以知道，單獨(dú)抗-HCV抗體陽性已不能診斷HCV是否感染，同時(shí)也不能作為臨床選擇抗病毒治療和監(jiān)測療效的依據(jù)。血清中的HCV RNA是病毒復(fù)制和肝炎進(jìn)程的確切標(biāo)志，檢測血清HCV RNA是診斷HCV病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)，而抗體僅作為篩查或輔助判斷的指標(biāo)存在。

在重復(fù)性對比試驗(yàn)中，氯仿-異丙醇法的變異系數(shù)為38.13%，而核酸分離柱法的變異系數(shù)僅為11.98%。兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可知核酸分離柱法的重復(fù)性明顯好于氯仿-異丙醇法。

綜上所述，作者所測的兩種HCV RNA提取法，即核酸分離柱法和氯仿-異丙醇法，在RNA提取效率上相差無幾，但是在重復(fù)性對比中，核酸分離柱法則明顯優(yōu)于氯仿-異丙醇法，并且其避免了使用有毒試劑，對檢測人員更安全，因此在臨床上更推薦使用核酸分離柱法。在血清檢測中，血清是否溶血往往會(huì)影響到檢測結(jié)果，在檢測過程中，標(biāo)本的成分含量差異、生產(chǎn)廠家試劑、采用的不同核酸提取方法，都會(huì)影響標(biāo)本中HCV RNA模板的質(zhì)量，從而對丙型肝炎的篩查、診斷造成影響。因此，不僅僅是核酸的提取法，臨床上對于丙肝的準(zhǔn)確診斷，還需在其他方面投入一定精力，以期達(dá)到更好的結(jié)果。

［1］ 姚磊，張征，黃紹光，等.乙型肝炎不同血清學(xué)模式HBV DNA定量檢測及其與Pre-S1關(guān)系的研究．重慶醫(yī)學(xué)，2006，35(1):60-62．

［2］ 李金明.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)．北京:人民軍醫(yī)出版社，2007．

［3］ 劉佳，徐軍，王雪飛，等.3種HBV DNA提取方法對熒光定量PCR檢測結(jié)果影響的比較．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，31(7):780-783．

［4］ 姚航平，夏大靜，張立煌，等.慢性丙型肝炎的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白、白細(xì)胞分化抗原54和白介素18的水平及意義．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2001，1(25):49．

［5］ 趙秀麗，單實(shí)年，張建瓊，等.樹狀DNA技術(shù)在HCV檢測中的應(yīng)用．臨床檢驗(yàn)雜志，2003，1(21):27．

［6］ 王志明，譚復(fù)明，陳偉華，等.輸血后丙型肝炎病毒感染的血清病毒定量研究．中華傳染病雜志，2000，1(18):37．