油菜種皮色素的研究進(jìn)展

唐志東，魯軍雄，袁玉輝

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)/國家油料改良中心湖南分中心，長沙410128)

菜籽顏色由種皮中色素物質(zhì)的組成決定，同時(shí)色素物質(zhì)也作為信號分子和植物抗菌素參與逆境脅迫、種子休眠等生理過程［1］。研究種皮中主要色素物質(zhì)對種皮顏色的影響和測量方法有助于了解種皮顏色的形成機(jī)理，在理論研究與育種實(shí)踐上具有重要意義。

1 油菜種皮化學(xué)組成

油菜種皮成分復(fù)雜，含有水、蛋白質(zhì)、糖類、礦物質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素、色素等。相同的油菜品種，由于地區(qū)、土壤、氣候、生產(chǎn)條件、收獲時(shí)間的差異，造成其種皮中相關(guān)成分的含量各不相同。Naczk等［2］分析了甘藍(lán)型油菜種皮主要成分，發(fā)現(xiàn)含油量為5.5±0.1%，蛋白質(zhì)含量為15.1±0.1%，灰分含量為5.2±0.1%，食用纖維含量為66.3±0.8%。劉運(yùn)榮等［3］對油菜種皮中主要成分含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)油菜種皮的水、蛋白質(zhì)、油、不溶性膳食纖維、單寧含量分別為 10.08%、10.20%、5.15%、46.60%、3.00%。

油菜種皮中色素物質(zhì)包括葉綠素、葉黃素、多酚、類黃酮、花色素和黑色素等［4］。

在蕓薹屬作物種子中，類黃酮物質(zhì)主要有山奈酚衍生物、槲皮素衍生物、異鼠李素衍生物、表兒茶素糖苷［5］。油菜種皮中的類黃酮主要包括黃酮醇、原花青素(PCs，表兒茶素低聚物)、(－)－表兒茶素等，其黃酮醇主要為山奈酚、槲皮素和異鼠李素的衍生物［6，7］(表 1)。不溶性的原花色素(PAs，也稱作縮合丹寧)在成熟種子的種皮中大量積累，是一類由黃烷3－醇的聚合物與蛋白質(zhì)、多糖等大分子結(jié)合的產(chǎn)物。油菜黃、黑籽種皮中都不含花青苷［8］。

圖1 油菜種皮中主要類黃酮的結(jié)構(gòu)式

表1 油菜種皮中主要類黃酮［7～9］

油菜種皮黑色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和合成途徑一直沒有定論。植物黑色素大部分是由黃烷3－醇、黃烷3，4－二醇等酚類物質(zhì)經(jīng)過多酚氧化酶催化后形成的鄰苯醌。這些鄰苯醌本來沒有太深的顏色，但因其擁有大量的助色團(tuán)酚羥基，而使顏色迅速加深。葉小利等［4］用高效液相色譜(HPLC)分析了甘藍(lán)型黃、黑籽油菜種皮黑色素的組成，發(fā)現(xiàn)黃、黑籽種皮黑色素組成相同，為吲哚型和鄰苯二酚型組成的混合黑色素，這種黑色素以游離酪氨酸和多酚為前體合成，可見，酚羥基酶在多酚轉(zhuǎn)換為黑色素的過程中起到了重要作用。

2 油菜種皮中色素物質(zhì)對顏色的影響

不同顏色油菜種皮中相關(guān)色素物質(zhì)存在差異。曾盔等［10，11］發(fā)現(xiàn)，芥菜型黃籽種皮的多酚含量為黑籽種皮的70%，而甘藍(lán)型黃籽種皮中的多酚僅為黑子種皮的10%。Lipsa等［12］測定了166個(gè)DH群體黃、黑籽油菜種皮中的總黃酮含量，發(fā)現(xiàn)油菜種皮顏色與總黃酮含量的相關(guān)性非常低，說明類黃酮對油菜種皮顏色沒有直接的影響。葉小利等［13］研究結(jié)果顯示，甘藍(lán)型黃、黑籽油菜種皮中的多酚、類黃酮、花色素、黑色素達(dá)到極顯著差異，在種子發(fā)育的初、中期，多酚、類黃酮、花色素是影響種皮色澤差異的主要因素，在種子發(fā)育后期，黑色素是影響種皮色澤的主要因素。梁穎等［14］研究了甘藍(lán)型油菜種皮中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、谷氨酰胺合成酶(GS)的差異，發(fā)現(xiàn)相同遺傳背景下，黑籽油菜種皮中PAL和PPO的含量高于黃籽種皮，GS的含量則沒有顯著的差異。Lepiniec等［6］用高效液相色譜(HPLC)測定種皮中的PAs，發(fā)現(xiàn)黃籽種皮中不含表兒茶素。Marles等發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜黑籽種皮中木質(zhì)素含量明顯高于黃籽種皮，黑籽種皮中PAs含量最高可達(dá)到10 mg/g，而存在黑色斑點(diǎn)的黃籽油菜種皮中才含有微量的 PAs［8］。Routaboul等［15］發(fā)現(xiàn)，油菜種皮中的PAs首先是以無色的形式存在，然而在種子干燥過程中其顏色逐漸變深。Auger等［7］認(rèn)為在種子發(fā)育后期，種皮中的PAs有一個(gè)被氧化的過程，被氧化的PAs很難被提取出來，并且導(dǎo)致種皮顏色變深，這與種皮顏色的變化過程相吻合。在野生型的擬南芥種皮中，PAs為主要的色素，其包括了原矢車菊素和槲皮素等衍生物，PAs被氧化后造成種皮顏色的改變。擬南芥tt突變體種皮中的色素主要為黃酮醇類物質(zhì)，這導(dǎo)致了種子的外觀為黃色［16］。這些研究都說明，PAs這種類黃酮才是種皮顏色形成的決定性物質(zhì)，而其他物質(zhì)(木質(zhì)素、黃酮醇等)對種皮顏色的形成可能只起輔助作用。

3 油菜種皮類黃酮的檢測方法

3.1 定量檢測方法

有機(jī)溶劑提取是提取類黃酮主要的方法，甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚等都可以提取類黃酮。乙醇和甲醇是使用最多的兩種提取物，苷元類物質(zhì)適合用高濃度的醇(90% ～95%)提取，苷類物質(zhì)適合用60%左右的醇提?。?7］。Auger等［7］用甲醇/丙酮/水/TFA(40∶32∶28∶0.05，v/v/v/v)提取甘藍(lán)型油菜種皮中的類黃酮。Routaboul等［18，19］用乙腈/水(75∶25，v/v)提取擬南芥種皮類黃酮。超聲波輔助提取法、微波輔助提取法的運(yùn)用能顯著提高黃酮類物質(zhì)的提取效率［20，21］。

分光光度法是測定總黃酮含量的主要方法。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，利用類黃酮的3－或5－OH及鄰二酚羥基能與Al3+絡(luò)合，在加入NaOH后即生產(chǎn)紅色物質(zhì)，于510 nm處測定其吸光度并計(jì)算出類黃酮含量。萬華方等［22］用5%的HCl－甲醇溶液提取油菜種皮可溶性色素，分別在600 nm、530 nm(花色素)、325 nm(類黃酮)、280 nm(多酚)波長測定吸光度，通過換算得到花色素、類黃酮、多酚的含量，最后再向殘?jiān)屑尤?%NaOH提取黑色素，于290 nm處測定其吸光度并計(jì)算出黑色素含量。

PAs是油菜種皮主要的類黃酮，在酸性條件下PAs的化學(xué)活性較高，其上的間苯三酚和間苯二酚可與香草醛發(fā)生縮合，并在濃酸條件下形成有色的碳正離子，測其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出樣品中的 PAs含量［23］。甘藍(lán)型黑籽油菜種皮中的PAs含量達(dá)到19.13～62.13 mg/g，其中不能溶解的PAs占總 PAs的70% ～ 95.8%［24］，不同的提取方法和不同的材料都可以導(dǎo)致測量結(jié)果的差異。

表2 不同方法提取油菜種皮中PAs結(jié)果

3.2 定性檢測方法

3.2.1 紫外光譜法

各類黃酮都含有特征的紫外吸收光譜，不同的類黃酮由于分子中共軛體系和羥基數(shù)目、位置和存在形式的不同，導(dǎo)致其紫外－可見吸收光譜發(fā)生有規(guī)律的變化。類黃酮在醋酸鈉、三氯化鋁、氫氧化鈉、三氯化鋁/鹽酸、硼酸/醋酸鈉等試劑的作用下，紫外光譜吸收帶的變化與結(jié)構(gòu)有一定關(guān)系，目前已有大量的數(shù)據(jù)、規(guī)律可供參考［29，30］。曾盔等［11］根據(jù)種皮提取液的紫外－可見光譜結(jié)果進(jìn)行綜合分析、比對，推測出種皮中的黃酮類多酚含有黃烷酮(醇)類分子，根據(jù)位移試劑導(dǎo)致的譜帶藍(lán)移和紅移得出黑籽種皮中含C環(huán)有3－OH的黃烷醇類分子，黃籽種皮含A環(huán)有單酚羥基的黃酮醇類分子。

3.2.2 質(zhì)譜(MS)法

MS對油菜種皮中類黃酮進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，可以獲得化合物的分子量、分子式和特征碎片等信息。Auger等［7］利用 LC－ESI－MSn技術(shù)細(xì)致分析了甘藍(lán)型油菜種皮中類黃酮的含量與組成。提取的可溶性類黃酮首先在m/z200到m/z2000的范圍掃描，鑒定出主要的類黃酮。然后用ESI－MSn并結(jié)合碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)譜對其進(jìn)行分析后得出種皮類黃酮的裂解特征。為了得到實(shí)際質(zhì)量的離子，飛行時(shí)間型(TOF)質(zhì)譜結(jié)合電噴霧電離(ESI)以及高效液相色譜(HPLC)被用來進(jìn)行綜合的分析。研究結(jié)果顯示出甘藍(lán)型油菜種皮中的PAs是由(－)－表兒茶素組成的聚合物，5種原花青素(PCs)和7種黃酮醇被發(fā)現(xiàn)。Routaboul等［15］用 HPLC－ESI－MSMS技術(shù)對擬南芥種子中的類黃酮提取物研究，發(fā)現(xiàn)了26種黃酮醇物質(zhì)，其中槲皮素3－O－鼠李糖苷是最主要的成分。用野生型擬南芥與11種tt突變體的測定結(jié)果進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，它們的類黃酮含量和種類各不相同，不同的基因型導(dǎo)致了不同的類黃酮含量。

3.2.3 核磁共振(NMR)法

1H NMR和13C NMR是鑒定黃酮化合物的結(jié)構(gòu)類型、確定取代基的位置和進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究的有效辦法。1H NMR的一般步驟為:首先，應(yīng)用化學(xué)位移的知識(shí)，結(jié)合譜峰面積確定的氫原子數(shù)目，確定化合物中氫官能團(tuán)的種類、結(jié)構(gòu);其次，應(yīng)用n+1規(guī)律或二級偶合裂分，確定分子中基團(tuán)和基團(tuán)間的關(guān)系;再次，計(jì)算偶合常數(shù)，確定分子的構(gòu)像或立體構(gòu)型。13C NMR一般是在1H NMR譜解析的基礎(chǔ)上開展的，對13C NMR的綜合分析可以得到化合物分子結(jié)構(gòu)所含碳原子的個(gè)數(shù)、化合物分子結(jié)構(gòu)中各種可能的含碳官能團(tuán)、化合物的結(jié)構(gòu)骨架。Kerhoas等［19］運(yùn)用MS與NMR對擬南芥種皮中的黃酮苷進(jìn)行研究，鑒定出了槲皮素3－O－α－吡喃鼠李糖苷，山奈酚3－O－α－吡喃鼠李糖苷等3種黃酮苷物質(zhì)以及其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

3.2.4 類黃酮物質(zhì)的立體化學(xué)分析

許多類黃酮都含有不對稱的碳原子，這使得類黃酮化合物有不同的絕對構(gòu)型。目前，測定其化合物絕對構(gòu)型的方法有圓二色光譜法。當(dāng)平面偏振光通過含有生色團(tuán)的光學(xué)活性物質(zhì)時(shí)，其左、右圓偏振光的吸收值不同，造成通過的左、右圓偏振光速度與振幅不同，使疊加產(chǎn)生的偏振光將不再是平面偏振光，而是橢圓偏振光，通過這種橢圓率就可以得到圓二色譜(CD)，此法是測定類黃酮絕對構(gòu)型的最常用方法［31］。另外還有晶體X射線衍射法。X射線是一種波長為0.001～50 nm的電磁波，當(dāng)X射線照射到晶體上時(shí)，晶體周圍會(huì)產(chǎn)生周期變化的電磁場，隨之使原子中的電子發(fā)生周期性振動(dòng)。因此，每一個(gè)原子都是散射X射線的中心，這些散射波的相干產(chǎn)生了一副衍射圖像，從衍射圖中可以得到分子的結(jié)構(gòu)信息。此方法可靠性高，但一般要求被測物可形成良好的晶型，而且測定費(fèi)用高［32］。此外，化學(xué)轉(zhuǎn)化法、旋光法等方法也可用來分析油菜種皮中類黃酮物質(zhì)的立體構(gòu)型。

3.2.5 組織化學(xué)分析法

甲苯胺藍(lán)(TBO)是一種多色性堿性染料，TBO可使細(xì)胞中的不同成分染成不同的顏色［33］。將成熟種子置于水中吸脹30 min，在放入樹脂包埋試劑盒之前，用5%戊二醛(v/v)水溶液固定。用薄片切片機(jī)切出2 mm厚的切片，再將切片浸泡在TBO溶液中，TBO將果膠纖維素染成粉紅色，將多酚類物質(zhì)染成藍(lán)綠色［34］。曲存民［9］對甘藍(lán)型油菜種子的TBO染色切片觀察后發(fā)現(xiàn)，授粉后14 d，黃、黑籽種臍部位均有PAs類多酚物質(zhì)積累;授粉后21 d，黑籽種皮中PAs類多酚物質(zhì)顯著增多，黃籽的變化不大;授粉后28 d，黃、黑籽種皮色素層均有大量色素積累，但色素的種類存在很大差異，黑籽中主要積累的是PAs;授粉后35 d，種皮柵欄層中色素物質(zhì)大量積累，黑籽種皮色素層的PAs明顯多于黃籽;授粉后42 d和49 d，種皮中色素物質(zhì)的積累沒有明顯增加。

DMACA組織化學(xué)染色法是黃烷3－醇和PAs的特定檢測方法。將種子或者脫蠟的種子切片置于新鮮配制的0.3%(w/v)DMACA－無水乙醇/12 mol HCl(1/1，v/v)溶液中浸泡1 h，然后用70%乙醇漂洗，通過顯微鏡、肉眼的觀察，被染成藍(lán)色的部位含有 PAs［35］。Auger等［7］用 DMACA 組織化學(xué)分析法對甘藍(lán)型油菜種皮中PAs的存在部位做了分析，發(fā)現(xiàn)授粉后的25 d，PAs就開始積累在種皮的色素層和種臍部位，成熟種皮中存在大量的PAs，而種胚中卻沒有。

二苯氨基苯基硼酸(DPBA)能與黃酮醇形成共軛產(chǎn)物，不同的共軛產(chǎn)物在紫外燈的激發(fā)下發(fā)出特殊的熒光。Auger等［7］根據(jù)這一原理，對甘藍(lán)型油菜種皮中的黃酮醇物質(zhì)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)種皮類黃酮提取物反應(yīng)后有微弱的橘黃色熒光;種胚的提取物表現(xiàn)出綠色的熒光;種子的提取物為橘黃色的熒光，對比山奈酚衍生物、槲皮素衍生物、異鼠李素衍生物分別與DPBA顯色后的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)種子、種皮中主要含有槲皮素衍生物，而種胚中主要含有山奈酚衍生物。這與擬南芥種皮中的觀測結(jié)果是一致的［36］。

PAs在酸性條件下，其單體兒茶素A環(huán)的活性增加，A環(huán)上的羥基可與香草醛發(fā)生縮合反應(yīng)，生成有色物質(zhì)［35］。陸贏等［37］利用這一原理，對黃、黑籽油菜種皮分別進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)黃籽種皮不能被染色，而黑籽種皮授粉后15 d即可染成特異性紅色。

4 結(jié)論和展望

油菜種皮中色素物質(zhì)很多，而PAs決定其顏色。在甘藍(lán)型、白菜型油菜中，PAs的合成已經(jīng)有了比較清晰的研究，而芥菜型油菜的相關(guān)研究還未見報(bào)道。黃酮醇在油菜中可能有重要的生理作用，目前已育成的黃籽品種大多農(nóng)藝性狀和抗性較差，這可能與黃酮醇物質(zhì)的改變有關(guān)。有針對性地改變種皮中類黃酮而不影響油菜植株中該物質(zhì)的含量，可以在不影響油菜正常生理的條件下改變油菜籽種皮顏色。但是這需要分別對黃、黑籽油菜種皮中色素物質(zhì)的差別進(jìn)行更加細(xì)致的研究。

模式植物擬南芥的種皮顏色調(diào)控機(jī)制和油菜種皮具有高度的保守性，能給研究人員大量的啟發(fā)。將來，黃色油菜種皮基因的精細(xì)定位、不同顏色油菜種皮色素的種類和結(jié)構(gòu)差異分析將對黃籽油菜的育種起到促進(jìn)作用。

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