常壓敞開式質(zhì)譜成像技術(shù)及其應(yīng)用*

馮鮑盛 白玉 劉虎威

(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院 北京100871)

俗語(yǔ)說(shuō)“一畫勝千言”。一張圖片可以很好地幫助人們理解非常復(fù)雜的道理?？茖W(xué)研究領(lǐng)域也是如此，圖像可以幫助我們更好地、更直觀地理解其背后的深?yuàn)W科學(xué)原理以及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因而，成像技術(shù)及其應(yīng)用是目前科研領(lǐng)域的一個(gè)非常熱門的研究方向。比如，在醫(yī)院診斷中運(yùn)用非常成熟的磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emission computed tomography，PET)和計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)以及在實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常使用的熒光成像、原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)和掃描隧道顯微鏡(scanning tunnel microscope，STM)等。商品化的MRI等技術(shù)可以直接對(duì)人體的組織進(jìn)行無(wú)創(chuàng)的快速成像，但是其分辨率較低，只有1mm3～1cm3［1-2］。相比之下，熒光成像則可以達(dá)到非常高的分辨率［3］。由于熒光成像通常需要對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行標(biāo)記，因而會(huì)改變被分析物所處的原始環(huán)境，并可能造成標(biāo)記后物質(zhì)分布與標(biāo)記前有所區(qū)別，從而不利于原位的分析和檢測(cè)。AFM和STM兩種技術(shù)雖然可以直接進(jìn)行原子級(jí)別分辨率的成像，但它們不能對(duì)被測(cè)物質(zhì)本身進(jìn)行定性的分析［4］。

質(zhì)譜成像(mass spectrometry imaging，MSI)是將成像處理軟件與質(zhì)譜的離子掃描技術(shù)相結(jié)合的一種新型成像方法。相對(duì)于傳統(tǒng)的成像方法，質(zhì)譜成像具有免熒光標(biāo)記、不需要復(fù)雜樣品前處理、可以提供豐富的被分析物空間分布信息等優(yōu)點(diǎn)。與核磁共振或者正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像相比，質(zhì)譜成像有更高的空間分辨率;而相對(duì)于熒光成像，質(zhì)譜成像所需的樣品前處理步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，而且不需要熒光標(biāo)記，避免了可能引起的樣品原始狀態(tài)的改變。質(zhì)譜技術(shù)可以根據(jù)被分析物的不同質(zhì)荷比，分析從小分子到生物大分子等物質(zhì);結(jié)合成像技術(shù)，可以直觀地給出較高分辨率的被分析物空間分布情況。因此，質(zhì)譜成像技術(shù)越來(lái)越多地受到人們的關(guān)注，成為成像研究領(lǐng)域的一個(gè)新熱點(diǎn)。

1 質(zhì)譜成像技術(shù)及常壓敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜成像通常可以按照質(zhì)譜分析所用的離子化方法進(jìn)行分類。目前較為成熟的質(zhì)譜成像商用儀器有兩種:二次離子質(zhì)譜(secondary ion mass spectrometry，SIMS)以及基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry，MALDI-MS)。SIMS和MALDI-MS都屬于解吸型離子化質(zhì)譜(圖1)。SIMS是在高真空環(huán)境中，利用高能初級(jí)離子束(例如Ar+、Au3+、等)轟擊樣品表面［5］，使得樣品表面的一部分物質(zhì)被解吸下來(lái)并離子化，產(chǎn)生的次級(jí)離子再進(jìn)入質(zhì)量分析器，進(jìn)而被檢測(cè)分析。SIMS可以達(dá)到目前質(zhì)譜成像中最高的空間分辨率——幾十納米［6］，但由于其初級(jí)離子束能量較高，易產(chǎn)生碎片離子，其質(zhì)量分析范圍約2000kDa左右，對(duì)于大分子的檢測(cè)靈敏度不高，因而其目前主要用于小分子化合物的質(zhì)譜成像研究。MALDI是2002年獲得諾貝爾獎(jiǎng)的新型離子化方法，可以對(duì)生物蛋白質(zhì)大分子進(jìn)行離子化，大大拓寬了質(zhì)譜的分析范圍，也為質(zhì)譜成像帶來(lái)了新的可能。在MALDI-MS離子化過(guò)程中發(fā)揮最重要作用的是基質(zhì)。在非成像的MALDI-MS分析過(guò)程中，被分析物和過(guò)量的基質(zhì)混合共結(jié)晶，基質(zhì)的量是被分析物的103～105倍［7］。MALDI的解吸和離子化是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，基質(zhì)吸收激光的能量，與被分析物共同解吸附到氣相中，此過(guò)程中同時(shí)發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，使分析物在氣相中帶上電荷，進(jìn)而進(jìn)入質(zhì)量分析器進(jìn)行檢測(cè)。在MALDI-MS成像過(guò)程中，首先需要在樣品表面均勻噴涂上基質(zhì)溶液。除了作為基質(zhì)外，該溶液還可原位地將被分析物從樣品中萃取，進(jìn)而進(jìn)行質(zhì)譜分析［8］。MALDI-MS成像在質(zhì)譜成像領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但基質(zhì)的噴涂可能造成小分子化合物以及蛋白質(zhì)等待分析物的擴(kuò)散和移位現(xiàn)象，此外，成像分辨率受限于激光光斑直徑大小和共結(jié)晶的直徑大小，一般在20μm左右［9-10］?；|(zhì)的使用易對(duì)中低相對(duì)分子質(zhì)量化合物的MALDI-MS成像造成干擾。

圖1 MALDI-MS(A)和SIMS(B)原理示意圖［8］

SIMS和MALDI-MS兩種質(zhì)譜成像技術(shù)的發(fā)展都較為成熟，且均有商品化儀器。它們的質(zhì)譜掃描過(guò)程均需要在高真空條件下進(jìn)行，無(wú)法進(jìn)行實(shí)時(shí)原位的分析。隨著2004年常壓敞開式離子化質(zhì)譜概念的提出［11］，各種各樣的常壓敞開式離子化技術(shù)紛紛涌現(xiàn)出來(lái)，為質(zhì)譜成像技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供了新的技術(shù)支持。

常壓敞開式離子化技術(shù)主要有以下幾方面特點(diǎn)［12］:①離子化過(guò)程在常壓或者開放環(huán)境中進(jìn)行;②無(wú)需或者只需簡(jiǎn)單的樣品前處理;③可以和絕大多數(shù)的商品化質(zhì)譜儀結(jié)合;④電離方式軟，產(chǎn)生的碎片較少。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前已經(jīng)有幾十種常壓敞開式離子化方法。按照離子化過(guò)程和作用機(jī)理，大體可以分為以下幾類［12-14］:1)基于噴霧和固液萃取的離子化技術(shù):解吸電噴霧電離(desorption electrospray ionization，DESI)，探針電噴霧電離(probe electrospray ionization，PESI)，納噴霧解吸電噴霧電離(nanospraydesorption electrospray ionization，nanoDESI)，萃取電噴霧電離(extractive electrospray ionization，EESI)，簡(jiǎn)易敞開式聲波噴霧電離(easy ambient sonic spray ionization，EASI);2)基于等離子體的離子化技術(shù):實(shí)時(shí)直接分析(direct analysis in real time，DAＲT)，低溫等離子體(low-temperature plasma，LTP)，解吸電暈束電離(desorption corona beam ionization，DCBI);3)基于激光解吸消融的離子化技術(shù):紅外激光消融亞穩(wěn)誘導(dǎo)化學(xué)離子化(infrared laser ablation metastable-induced chemical ionization，IＲ-LAMICI))，電噴霧激光解吸電離(electrospray laser desorption ionization，ELDI)，激光消融電噴霧電離(laser ablation electrospray ionization，LAESI)，基質(zhì)輔助激光解吸電噴霧電離(matrix-assisted laser desorption electrospray ionization，MALDESI);4)基于聲波解吸的離子化技術(shù):激光誘導(dǎo)聲波解吸電噴霧電離(laser-induced acoustic desorption-electrosprayionization，LIAD-ESI)，射頻聲波解吸電離(radio-frequency acoustic desorption and ionization，ＲADIO)。

目前已經(jīng)報(bào)道的用于質(zhì)譜成像的常壓敞開式離子化方法還不多。下面將對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)的討論。

2 常壓敞開式離子化質(zhì)譜成像

2.1 解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像

解吸電噴霧電離(desorption electrospray ionization，DESI)是第一種被報(bào)道的常壓敞開式離子化技術(shù)［11］，也是目前常壓敞開式離子化質(zhì)譜成像領(lǐng)域研究最多的一種方法。

DESI是一種常壓、常溫、敞開式、原位、基本不需要樣品前處理也不需要基質(zhì)輔助的可以分析小分子和生物大分子的軟電離技術(shù)［15］。如圖2所示，在霧化氣的帶動(dòng)下，溶劑在高壓下形成電噴霧，并以一定角度吹掃樣品表面;在與樣品表面的分子接觸過(guò)程中，將部分被分析物分子溶解，并且形成次級(jí)帶電液滴束;次級(jí)帶電液滴束以合適的角度噴入質(zhì)譜入口，進(jìn)而進(jìn)行檢測(cè)和分析。由于DESI基本不需要樣品前處理或者額外的基質(zhì)輔助就可以對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，因而可將其用于樣品的原位檢測(cè)。但截至目前，DESI仍存在一些不足，如不同的電噴霧溶劑組成對(duì)樣品表面分子的溶解和電離存在一定的選擇性;此外，DESI成像的分辨率受其噴霧空間分辨率的限制，一般約為200μm。雖有報(bào)道可以通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件將分辨率提高至40μm左右［16］，但與SIMS和MALDI-MS相比，分辨率仍較低。DESI作為一種新型的常壓敞開式離子化技術(shù)，過(guò)去幾年里在質(zhì)譜成像領(lǐng)域已有諸多應(yīng)用，如法醫(yī)鑒定、組織成像、代謝物分析及三維組織成像分析等。

圖2 DESI的原理示意圖［11］

Ifa等人［17］報(bào)道了利用DESI-MS進(jìn)行字跡鑒定以及成像方法的研究，他們采用逐行掃描的方式對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，并利用成像軟件將結(jié)果分析匯總得出成像結(jié)果。進(jìn)而利用這一方法進(jìn)行了筆跡［18］以及犯罪現(xiàn)場(chǎng)指紋［19］的質(zhì)譜成像研究(圖3)。Dill等人［20］報(bào)道了利用DESI-MS成像研究腫瘤細(xì)胞及胸腺組織切片上脂質(zhì)的不同分布。Manicke等人［21］將高分辨的軌道阱質(zhì)譜(orbitrap-MS)與DESI聯(lián)用，對(duì)小鼠大腦的脂質(zhì)進(jìn)行了質(zhì)譜成像，并比較了不同脂質(zhì)的分布區(qū)別。Watrous等人［22］利用DESI-MS對(duì)枯草桿菌和鏈霉菌的二次代謝產(chǎn)物進(jìn)行成像分析，為藥物開發(fā)中天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)提供了新的有效途徑。Lane等人［23］則報(bào)道了熱帶藻類組織表面的抗菌物質(zhì)分布情況，為進(jìn)一步研究其生理功能提供了基礎(chǔ)。

圖3 DESI指紋成像研究［19］

除了可以進(jìn)行常規(guī)的二維成像分析，DESI-MS還可以對(duì)生物組織進(jìn)行三維成像。Cooks等人利用該方法報(bào)道了小鼠腦中的脂質(zhì)類化合物分布的三維質(zhì)譜成像結(jié)果(圖4)［24］。首先選擇一片組織切片，確定了小鼠腦中的兩種特征離子(m/z834.4為PS 18:0/22:6，m/z 888.8為ST 24:1)。然后將小鼠大腦組織切成36片，對(duì)每個(gè)切片分別進(jìn)行成像，再將結(jié)果疊加起來(lái)，得到完整的三維小鼠大腦質(zhì)譜成像圖，證明了DESI-MS三維成像的可能性，并據(jù)此研究了小鼠大腦的特征物質(zhì)分布情況。

圖4 小鼠大腦DESI三維成像結(jié)果［24］

2.2 其他常壓敞開式離子化質(zhì)譜成像研究

2.2.1 低溫等離子體質(zhì)譜成像

低溫等離子體(low-temperature plasma，LTP)［25］是一種新型的常壓敞開式離子化技術(shù)，原理如圖5所示。氣體在電場(chǎng)放電作用下產(chǎn)生低溫的等離子體，進(jìn)而噴射到樣品表面，使待測(cè)物質(zhì)解吸并離子化。LTP的溫度一般為30℃，載氣為He、Ar或空氣。其特點(diǎn)是對(duì)樣品的損傷小，溫度低，產(chǎn)生的離子碎片少。張新榮等人［26］報(bào)道了利用LTP低溫?zé)o損等分析特點(diǎn)，對(duì)藝術(shù)品上的印章油墨成分進(jìn)行質(zhì)譜成像分析，實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化的成像掃描速度為270μm/s，等離子體直徑為150μm。選取m/z71、83和116三個(gè)離子作為特征離子，對(duì)藝術(shù)品的真品和贗品進(jìn)行了對(duì)比分析。

2.2.2 激光消融電噴霧電離質(zhì)譜成像

Nemes等人［27］報(bào)道了一種將激光和ESI結(jié)合的新型常壓敞開式離子化方法——激光消融電噴霧電離(laser ablation electrospray ionization，LAESI)。其實(shí)驗(yàn)所用到的激光為波長(zhǎng)2940nm的紅外激光，能量為3.5mJ，直徑為350μm;ESI部分利用甲醇-水溶液(V(甲醇):V(水)=1:1)形成的電噴霧。其原理是被分析物先被激光消融解吸后再由電噴霧進(jìn)行離子化并進(jìn)入質(zhì)量分析器進(jìn)行檢測(cè)(圖6)。LAESI不需要任何的樣品前處理過(guò)程，其質(zhì)量檢測(cè)范圍涵蓋了小分子到大分子，方法檢測(cè)限為8fmol。方法的不足之處在于要求被分析體系含有一定量的水分。Nemes等人［28］利用LAESI-MS對(duì)富含水分的生物組織樣品(例如小鼠大腦)進(jìn)行了質(zhì)譜成像;并利用LAESI的300μm二維空間分辨率和30～40μm的深度分辨率，將不同深度的獨(dú)立二維成像結(jié)果相疊加，從而得到了三維的組織成像結(jié)果［29］。

圖5 LTP-MS［25］

圖6 LAESI-MS原理示意圖［27］

2.2.3 紅外激光消融亞穩(wěn)誘導(dǎo)化學(xué)電離

Fernandez等人［30］報(bào)道了常壓敞開式離子化技術(shù)——紅外激光消融亞穩(wěn)誘導(dǎo)化學(xué)電離(infrared laser ablation metastable-induced chemical ionization，IR-LAMICI)，原理如圖7所示。首先是用紅外激光脈沖轟擊樣品表面，將其表面的分子消融并解吸;解吸下來(lái)的被分析物和處于激發(fā)態(tài)的亞穩(wěn)態(tài)氣體分子相互作用而離子化。利用激光有效提高質(zhì)譜的空間分辨率，該裝置可以較好地對(duì)小分子進(jìn)行成像分析。利用IR-LAMICI-MS對(duì)藥片進(jìn)行質(zhì)譜成像分析的結(jié)果見(jiàn)圖8。

2.2.4 探針電噴霧電離質(zhì)譜成像

圖7 IR-LAMICI-MS原理示意圖［30］

圖8 IR-LAMICI-MS對(duì)藥片中乙酰氨基苯酚單體(m/z=152)和二聚體(m/z=303)的質(zhì)譜成像［30］

Hiraoka等人［31］報(bào)道了利用固體探針實(shí)現(xiàn)電噴霧的常壓敞開式離子化方法——探針電噴霧電離(probe electrospray ionization，PESI)。PESI離子化方法利用電動(dòng)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)可上下豎直移動(dòng)的固體探針，探針首先下降并接觸樣品，樣品表面或內(nèi)部的物質(zhì)(視下降深度而定)粘附到探頭上，從而完成采樣。當(dāng)探針上升到固定位置，在其上加3kV高壓，從而在探針的尖端產(chǎn)生電噴霧，進(jìn)而進(jìn)入質(zhì)量分析器進(jìn)行檢測(cè)。其原理如圖9所示。Chen等人［32］報(bào)道了利用PESI對(duì)液體被分析物進(jìn)行分析，對(duì)小鼠大腦組織進(jìn)行了磷脂的質(zhì)譜成像研究等。由于PESI的分辨率取決于探針尖端的直徑大小，因此，實(shí)驗(yàn)利用很細(xì)的探針達(dá)到了60μm的高空間分辨率。

2.2.5 納噴霧解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像

Laskin等人［33］報(bào)道了一種新型的常壓敞開式離子化方法——納噴霧解吸電噴霧電離(nanospray desorption electrospray ionization，nanoDESI)。其原理如圖10所示，溶劑在初始毛細(xì)管和噴霧毛細(xì)管間形成液橋并接觸樣品表面，從而將被分析物從樣品表面萃取出來(lái)。被分析物和溶劑在電場(chǎng)作用下，在噴霧毛細(xì)管中形成電噴霧，進(jìn)而進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)與分析。Laskin等人［34］利用nanoDESI進(jìn)行了質(zhì)譜成像研究(其空間分辨率可以達(dá)到12μm)，并利用該裝置對(duì)小鼠大腦的脂類分布進(jìn)行了研究。

圖9 PESI原理示意圖［31］

圖10 nanoDESI原理示意圖及其空間分辨率研究［34］

3 總結(jié)與展望

經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，質(zhì)譜成像已經(jīng)成為成像研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。質(zhì)譜成像的優(yōu)點(diǎn)是在提供研究對(duì)象空間分布信息的同時(shí)，可以提供其豐富的分子結(jié)構(gòu)信息，并且不需要對(duì)被分析物進(jìn)行標(biāo)記，也不需要復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程。更重要的是，成像分析之前不需要對(duì)被分析樣品有很多的了解，是一種探索發(fā)現(xiàn)型的研究方法?，F(xiàn)代質(zhì)譜儀器的迅猛發(fā)展，為質(zhì)譜成像提供了多種可供選擇的離子化方法，以及具有更高分辨率、靈敏度以及分析速度的新型質(zhì)譜儀，使得質(zhì)譜成像技術(shù)成為病理學(xué)、生物化學(xué)以及制藥分析等領(lǐng)域的有力工具。質(zhì)譜成像通過(guò)給出被分析物的結(jié)構(gòu)和分布信息，幫助人們認(rèn)識(shí)重大疾病等研究過(guò)程中的問(wèn)題和現(xiàn)象，有潛力成為實(shí)際醫(yī)學(xué)應(yīng)用等領(lǐng)域的常規(guī)分析方法。

截至目前，質(zhì)譜成像技術(shù)仍有很多問(wèn)題需要解決。例如成像的分辨率、靈敏度以及適用范圍的進(jìn)一步提高;規(guī)范化、快速的樣品前處理方法的開發(fā);質(zhì)譜成像分析過(guò)程中自動(dòng)化程度的提高;有效快捷的數(shù)據(jù)處理以及存儲(chǔ)方案等。由于常壓敞開式離子化技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)真正意義上的原位分析，為質(zhì)譜成像領(lǐng)域帶來(lái)了新的發(fā)展;但目前成像的空間分辨率、靈敏度和重復(fù)性等都有待于進(jìn)一步提升，這也是相關(guān)科技人員面臨的挑戰(zhàn)。

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