蒲公英水提物對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用

陳玉杰 (濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性病因不明的非特異性腸道炎癥，難以治愈、易復(fù)發(fā)，其病因、發(fā)病機(jī)制以及治療藥物研究一直是研究的熱點(diǎn)〔1〕。蒲公英(HT)含有多種有效成分，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用〔2〕。本文采用三硝基苯磺酸(TNBS)制備UC模型，探討蒲公英水提物對(duì)UC的治療作用。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物 健康SD大鼠62只，雌雄各半，體重(250±20)g，鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為SCXK(豫)2008-0001。

1.2 試藥 HT濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供，劉善庭教授鑒定為藥用 HT(T.offtcinale F.H.Wigg);TNBS(Sigma，批號(hào) 20090212)，用400 ml/L乙醇溶液將TNBS配制成50 g/L的溶液;柳氮磺胺吡啶(SASP，上海三維制藥有限公司，批號(hào):20090812);白細(xì)胞介素(IL)-8、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB(批號(hào) 100107，100209，090501，100412)，試劑均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 酶聯(lián)免疫(ELLSA)檢測(cè)儀(美國(guó)熱電-芬蘭雷勃酶標(biāo)儀，型號(hào) MK3);BP-190S電子天平(德國(guó) Sartorius公司);Beckman臺(tái)式高速離心機(jī)(Beckman公司)。

1.4 方法

1.4.1 HT的煎煮 HT加10倍量水，煎煮1 h，煎煮2次，過濾，合并2次濾液，濃縮至每毫升相當(dāng)于1 g原藥材，同時(shí)稀釋成所需要濃度。

1.4.2 UC模型的建立 選取SD大鼠52只，采用TNBS/乙醇法造模，烏拉坦麻醉大鼠，將直徑2 mm，長(zhǎng)約12 cm的塑膠管由大鼠肛門輕緩插入深約8 cm處，將TNBS按100 mg/kg推入大鼠結(jié)腸，誘導(dǎo)UC的形成〔3〕。模型制備10 d后，隨機(jī)選取2只處死，剖腹摘取直腸和結(jié)腸，0.9%氯化鈉清洗后肉眼可見結(jié)腸腸壁充血、水腫，內(nèi)壁紋理模糊，病理切片可觀察到大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜損傷等病理改變。確定造模成功。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.4.3 分組和給藥 造模后的50只大鼠，隨機(jī)分成模型組，HT水提物高、中、低劑量治療組，柳氮磺胺吡啶陽(yáng)性對(duì)照組(SASP組)，另設(shè)正常對(duì)照組，每組10只，HT低、中、高劑量治療組分別50、100、150 mg/kg給藥，SASP組每次400 mg/kg給藥，灌胃，1次/d，2 ml/次，連續(xù)14 d。正常對(duì)照組和模型組給予2 ml蒸餾水。

1.4.4 標(biāo)本采集 末次給藥后，禁食不禁水12 h，斷頭取血，取全血標(biāo)本2 ml于試管中，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min取血清，于-20℃冰箱冷凍保存。取結(jié)腸組織，中性甲醛固定，進(jìn)行肉眼大體形態(tài)評(píng)分，腸組織部分石蠟包埋，病理切片做蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.4.5 大體形態(tài)及組織學(xué)評(píng)分 大體形態(tài)按Ekstrom〔4〕標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，組織學(xué)評(píng)分參照 Dieleman等〔5〕標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)結(jié)腸潰瘍深度、范圍、炎癥程度進(jìn)行評(píng)分。

1.4.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法 ELISA法測(cè)定血清 IL-6、IL-10、TNF-α水平。免疫組化染色(SP法)檢測(cè)NF-κB p65表達(dá)，采用圖像分析，計(jì)數(shù)鏡下單位面積內(nèi)的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分級(jí)，染色積分為兩者乘積〔6〕。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，統(tǒng)計(jì)分析采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以±s表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大體形態(tài)評(píng)分和病理組織學(xué)評(píng)分 與正常對(duì)照組比較，模型組結(jié)腸黏膜明顯充血、水腫、糜爛和潰瘍;病理學(xué)檢查可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞脫落形成淺潰瘍，模型組組織大體評(píng)分和病理組織學(xué)評(píng)分明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，SASP和中、高劑量組大體評(píng)分和病理組織學(xué)評(píng)分明顯下降(P＜0.05)，潰瘍數(shù)量減少，充血水腫減輕，伴少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見表1。

2.2 HT水提物對(duì)UC大鼠 IL-6、IL-10、TNF-α水平的影響與正常對(duì)照組比較，模型組血清IL-6、TNF-α、NF-kBp65陽(yáng)性細(xì)胞含量明顯升高(P＜0.01)，IL-10含量明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較，SASP組和中、高劑量組TNF-α、IL-6、NF-kBp65陽(yáng)性細(xì)胞含量含明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，IL-10含量明顯升高(P＜0.05)。與SASP組比較，高劑量治療組與SASP療效相當(dāng)(P＞0.05)。見表2。

表1 大鼠結(jié)腸組織大體形態(tài)和病理組織評(píng)分(n=10，±s)

表1 大鼠結(jié)腸組織大體形態(tài)和病理組織評(píng)分(n=10，±s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 大體形態(tài)評(píng)分 病理組織學(xué)評(píng)分正常對(duì)照組0±0 1.03±0.29模型組 7.59±0.271) 11.97±1.331)SASP組 4.76±0.312) 8.29±0.572)HT低劑量組 7.11±0.32 10.07±1.27中劑量組 6.29±0.292) 9.44±1.072)高劑量組 4.98±0.392) 8.19±1.282)

表2 HT水提物對(duì)UC大鼠IL-6、IL-10、TNF-α、NF-kBp65陽(yáng)性細(xì)胞含量的影響(n=10，±s)

表2 HT水提物對(duì)UC大鼠IL-6、IL-10、TNF-α、NF-kBp65陽(yáng)性細(xì)胞含量的影響(n=10，±s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與模型組比較:3)P＜0.01

組別 IL-6(ng/L) IL-10(ng/L) TNF-α(ng/L) NF-kBp65陽(yáng)性細(xì)胞(%)正常對(duì)照組 52.67±10.33 40.21±5.37 31.39±9.27 0.21±0.27模型組 88.31±16.471) 18.39±4.551) 71.27±8.811) 0.41±0.081)SASP組 61.17±11.642) 36.74±4.573) 35.71±8.293) 0.27±0.033)HT低劑量組 81.47±14.17 21.61±5.39 64.18±8.98 0.38±0.041中劑量組 73.57±12.432) 26.17±4.53 46.29±9.322) 0.35±0.052)高劑量組 69.54±15.112) 34.17±4.192) 36.27±8.353)0.30±0.034

3 討論

目前，免疫調(diào)節(jié)異常在UC發(fā)病中作用日益受到重視，促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子參與了免疫反應(yīng)和炎癥過程，相互作用失去平衡，繼之導(dǎo)致結(jié)腸組織免疫損傷，從而產(chǎn)生一系列臨床癥狀。TNF-α、IL-6和IL-10作為重要的促炎性及抑炎性因子，與UC密切相關(guān)。TNF-α作為一種重要的免疫介質(zhì)，常與T淋巴細(xì)胞以及其他一些因子構(gòu)成復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)〔7〕，募集中性粒細(xì)胞至炎癥局部，誘發(fā)水腫和肉芽腫形，TNF-α還可通過激活NF-κB通路，上調(diào)IL-6等促炎介質(zhì)表達(dá)，使早期炎癥遷延〔8〕。IL-10為一種抑炎性細(xì)胞因子，可抑制IL-6等炎癥細(xì)胞因子合成，對(duì)UC具有保護(hù)作用。血漿IL-10濃度降低，導(dǎo)致細(xì)胞因子的相互作用失衡，加大炎性反應(yīng)，促使?jié)兊男纬伞?/p>

HT水提液降低癌細(xì)胞活性，發(fā)揮抗腫瘤作用，并在有效預(yù)防化學(xué)致癌方面有很大的發(fā)展前景，可安全用于臨床腫瘤治療，增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能。并能有效清除超氧陰離子自由基、羥自由基〔9〕。本研究顯示HT水提物能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的水平使腸黏膜免疫調(diào)節(jié)紊亂得以恢復(fù)，促進(jìn)潰瘍愈合。

綜上所述，HT水提物具有促進(jìn)UC腸黏膜修復(fù)、抑制機(jī)體炎癥和恢復(fù)免疫平衡的作用，其作用機(jī)制可能與抑制TNF-α、IL-6和NF-κB，上調(diào)IL-10水平有關(guān)。

1 于小華，劉曉華，趙浩如，等.腸安寧膠囊對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010;41(6):563-7.

2 姜 寧，宋新波.蒲公英的藥理研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)中醫(yī)藥志，2008;12(6):19-20.

3 奚苗苗，張三奇，顧 宜，等.果膠-酮洛芬前藥對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009;30(13):1231-4.

4 Ekstrom GM.Oxazolone-induced colitis in rats:effects of budesonide，cyclosporin A，and 5-aminosalicylic acid〔J〕.Scand J Gastroenterol，1998;33(2):174-9.

5 Dieleman LA，Palmen MJ，Akol H，et al.Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium(DSS)is characterized by Th1 and Th2 cytokines〔J〕.Clin Exp Immunol，1998;114(3):385-91.

6 陳建權(quán)，劉建平，郎曉猛，等.泄?jié)峤舛痉綄?duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-10、TNF-α 及 NF-κB 表達(dá)的影響〔J〕. 中華中醫(yī)藥雜志，2010;25(3):423-5.

7 劉曉玲，王汝俊，李燕舞，等.康腸寧對(duì)DNCB誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用〔J〕.中國(guó)新藥與臨床藥理，2010;21(3):248-50.

8 吳慧麗，李 慧.白芍總苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠細(xì)胞因子影響的研究〔J〕.中南藥學(xué)，2010;8(2):128-31.

9 吳曉春，杜勝利，陳海生.蒲公英的研究與應(yīng)用〔J〕.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2002;4(20):247-8.