拮抗菌RY3抗菌粗蛋白理化性質(zhì)及其對柑橘綠霉病菌的抑菌活性

陳召亮張 輝，2張娜娜，3喬勇進

CHEN Zhao－liang1ZHANG Hui1，2ZHANG Na－na1，3QIAO Yong－jin1

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海 201403；2.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093；3.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234）

由柑桔綠霉病菌PenicilliumdigitatumSacc.引起的柑橘綠霉病是導致柑橘采后腐爛損失的重要病害，腐爛率一般為10%～30%，嚴重時可達60%以上，嚴重制約著柑桔采后的貯運及銷售［1］。目前，化學殺菌劑處理是控制該病的主要方法［2，3］。但長期使用化學殺菌劑易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，且造成農(nóng)藥殘留，環(huán)境污染、危害人類健康等［4，5］。采用微生物及其代謝產(chǎn)物控制果蔬采后病害及進行生物保鮮已成為今年研究的熱點［6］。抗菌蛋白或抗菌多肽是許多生防微生物都能分泌的一類活性物質(zhì)，具有抗菌廣譜性和高效性、對人畜無毒、對環(huán)境無污染的優(yōu)良特性，且病菌對其不易產(chǎn)生抗性［7］。隨著人們食品安全意識和環(huán)保意識的增強，采用以抗菌蛋白為代表的生防制劑防治果蔬采后病害成為當今果蔬采后防腐保鮮的研究熱點。

解淀粉芽孢桿菌RY3是從冬棗果園根際土壤分離篩選獲得的一株高效拮抗細菌，前期預試驗表明其發(fā)酵液對柑橘青綠霉病菌、桃褐腐病菌、冬棗漿胞病菌等多種水果采后致病真菌具有較高的抑菌活性。為明確該拮抗菌的抗菌物質(zhì)的特性及對果蔬采后致病真菌的抗菌活性，本研究對其抗菌粗蛋白的理化性質(zhì)及其對柑橘采后綠霉病菌的抗菌活性進行了研究，以期為該拮抗菌在果蔬采后防腐保鮮中的進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

解淀粉芽孢桿菌RY3：由本實驗室從冬棗果園根際土壤中分離獲得；

柑橘綠霉病菌（Penicilliumdigitatum）：由本實驗室從綠霉病發(fā)病柑橘果實上分離獲得；

PDA培養(yǎng)基：200g馬鈴薯，20g葡萄糖，17g瓊脂粉，1 000mL蒸餾水；

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）［8］：牛肉膏5.0g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂18g、蒸餾水1 000mL、pH調(diào)至7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉10g／L、黃豆餅粉5g／L、碳酸氫銨10g／L、碳酸鈣5g／L，pH 調(diào)至7.0。

1.2 試驗儀器

高速冷凍離心機：Allegra X－22R型，美國Beckman coulter公司；

攝像顯微鏡：Axioskop 2plus型，德國卡爾蔡司公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX－250B－Z型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：BUCHI B－490型，瑞士Buchi公司；

空氣浴搖床：HWY211型，上海智誠分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 抗菌粗蛋白的制備 將活化好的RY3菌種按2%接入裝有125mL培養(yǎng)液的250mL的三角瓶中，在34℃、180r／min搖床上振蕩培養(yǎng)30h后，取發(fā)酵液，10 000r／min離心20min，收集上清液。將上清液倒入無菌三角瓶中，加入 HCl（7mol／L）調(diào)節(jié)pH＝2，過夜沉淀。再分裝于50mL的離心管，每管30mL，于4℃、10 000r／min離心25min，去上清液，向每管沉淀中加入1.5mL的甲醇（pH＝7），混合均勻，萃取8h。然后在4℃下10 000r／min離心20min，取上清液。同樣方法萃取兩次，合并上清液。將合并后的萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，每升細菌發(fā)酵液得到10mL抗菌粗蛋白。

1.3.2 抗菌粗蛋白理化性質(zhì)研究

（1）熱穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白分別于50℃／60min，80℃／30min，80℃／60min，100℃／30min，100℃／60min的條件下進行水浴處理，采用懸滴法［9］測定其對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制活性，每個處理重復3次，以未經(jīng)熱處理的抗菌粗蛋白為對照。

（2）對pH的穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白用1mol／L的鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，并于4℃貯存過夜，再將各pH值用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)回中性，測定其對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制活性，每個處理重復3次，測定方法同上，以未經(jīng)處理的抗菌粗蛋白做對照。

（3）對紫外線的穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白在20W紫外燈下距離10cm 處，照射2，4，6，8，10，12，14，24h，測定其對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制活性，每個處理重復3次，測定方法同上，以未經(jīng)處理的抗菌粗蛋白做對照，設(shè)抑菌率為100%。

（4）對蛋白酶的穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白分別用胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K在37℃處理60min，酶反應濃度為1mg／mL，測定其對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制活性，每個處理重復3次，測定方法同上，不加蛋白酶處理為對照。

1.3.3 抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌的抑菌活性

（1）抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)活性的影響：首先制備不同稀釋倍數(shù)的抗菌粗蛋白溶液和濃度為106個／mL的柑橘綠霉病菌分生孢子懸浮液（加入適量2%的蔗糖溶液），分別取抗菌粗蛋白、分生孢子懸浮液各1mL于編號試管中，充分混勻后，使抗菌粗蛋白稀釋倍數(shù)分別為10，20，50，100，200，400倍，以無菌水作對照，然后將藥液、孢子混合液滴在雙凹片上，放在帶有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)懸滴，每處理重復3次，25℃靜置培養(yǎng)24h，光學顯微鏡觀察統(tǒng)計視野內(nèi)孢子的總數(shù)和萌發(fā)的孢子數(shù)，按式（1）計算孢子萌發(fā)率，每重復調(diào)查100個孢子，以芽管長度大于分生孢子長直徑即視為萌發(fā)。

（2）抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)形態(tài)及菌絲形態(tài)的影響：采用瓊膠表面孢子萌發(fā)法，抗菌粗蛋白和PDA培養(yǎng)基按1∶9的比例制備平板，制備稀釋倍數(shù)為50倍的帶毒平板，采用涂布法接種綠霉病菌懸浮液（1.0×106個／mL），用攝像顯微鏡對孢子萌發(fā)、菌絲形態(tài)進行拍照。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌粗蛋白熱穩(wěn)定性

由表1可知，解淀粉芽孢桿菌RY3的抗菌粗蛋白經(jīng)50℃處理60min、80℃處理30min和60min后其抑菌活性與對照相比幾乎不變。經(jīng)100℃處理30min和60min后抑菌活性略有下降。由此可見抗菌蛋白對熱不敏感。

2.2 抗菌粗蛋白對pH的穩(wěn)定性

由圖1可知，酸性條件對抗菌粗蛋白的抑菌活性幾乎無影響，當pH值為2至6時，RY3的抗菌粗蛋白的抑菌活性幾乎無變化，均在原有活性的90%以上；堿性條件下抗菌蛋白活性下降明顯，pH值為8時抑菌活性稍有下降；pH值為10和12時，抗菌粗蛋白的抑菌活性下降幅度較大，與pH值為6時差異極顯著（P＜0.01）；當pH為14時，粗蛋白幾乎失去活性。說明RY3的抗菌粗蛋白耐酸但不耐堿，pH為14時抗菌物質(zhì)粗提物基本失去活性。

表1 不同溫度處理對抗菌粗蛋白抑菌活性的影響Table1 Effect of different temperature on inhibitory rate of antifungal crude protein

圖1 pH值對抗菌粗蛋白抑菌活性的影響Figure1 Effect of different pH on inhibitory activity of antifungal crude protein

2.3 抗菌粗蛋白對紫外線的穩(wěn)定性

由表2可知，紫外線照射6h對抗菌粗蛋白的活性基本無影響，抑菌活性均在原有活性的90%以上，隨著紫外光照射時間的繼續(xù)延長，抗菌蛋白的抑菌活性開始緩慢降低，紫外光照射12h時抑菌活性為原有活性的71.94%。說明抗菌粗蛋白耐紫外線。

表2 紫外照射時間對抗菌粗蛋白抑菌活性的影響Table2 Effect of different time of ultraviolet radiation on inhibitory rate of antifungal crude protein

2.4 抗菌粗蛋白對蛋白酶的穩(wěn)定性

由表3可知，該抗菌粗蛋白經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶處理后，活性幾乎不變；而蛋白酶K處理使其活性降低，但仍能保持原有活性的82.20%，說明抗菌粗蛋白對胃蛋白酶、胰蛋白酶不敏感，對蛋白酶K有一定的耐受性。

表3 不同蛋白酶對抗菌粗蛋白抑菌活性的影響Table3 Effect of different proteinases on inhibitory rate of antifungal crude protein

2.5 抗菌蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)的影響

由圖2可知，柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)活性隨抗菌粗蛋白濃度的增加而降低，呈現(xiàn)明顯的劑量效應，高濃度的抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)具有顯著的抑制活性，10，20倍抗菌蛋白稀釋液處理，孢子萌發(fā)率僅為2.86%和10.98%，說明該抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子具有明顯的抑制萌發(fā)活性。

圖2 抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌孢子萌發(fā)活性的影響Figure2 Effect of antifungal crude protein on germination activity of P.digitatum

2.6 抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)形態(tài)和菌絲形態(tài)的影響

抗菌粗蛋白可明顯影響孢子萌發(fā)形態(tài)和菌體形態(tài)，導致芽管和菌體的不正常生長。正常柑橘綠霉病菌孢子萌發(fā)的芽管及菌絲細長平滑（圖3（a）和圖3（c）），經(jīng)抗菌粗蛋白處理后的孢子芽管膨大變短變粗（圖3（b）和圖3（d））。菌體變粗，發(fā)生菌體細胞質(zhì)凝集現(xiàn)象（圖3（e））和菌絲消融現(xiàn)象（圖3（f））。

3 討論

解淀粉芽孢桿菌是一類具有廣譜抑菌活性的拮抗細菌，其主要通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)包括抗菌蛋白和脂肽類抗生素來發(fā)揮抗菌活性［10，11］。在抗菌蛋白研究方面，目前中國報道的耐熱抗菌蛋白較多［12，13］，但耐酸的抗菌蛋白報道相對較少［14］。本研究表明RY3產(chǎn)生的抗菌蛋白對熱及酸穩(wěn)定，耐紫外線，對胃蛋白酶、胰蛋白酶不敏感，對蛋白酶K具有一定的耐受性，這些性質(zhì)說明該抗菌蛋白可適應特殊復雜的環(huán)境條件，具有良好的應用前景。

本研究中發(fā)現(xiàn)該抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)具有明顯的抑制活性，且可導致芽管腫大變短及菌體細胞質(zhì)凝集、消融等畸形現(xiàn)象，這與孟利強等［15］和翟如環(huán)等［16］的研究結(jié)果一致。分生孢子是病原菌侵染的重要器官，柑橘綠霉病菌分生孢子活性萌發(fā)受到明顯抑制，芽管及菌體畸形等可使其致病侵染力顯著降低，從而可降低柑橘采后綠霉病的發(fā)生及有效減少采后損失。

圖3 抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌孢子萌發(fā)形態(tài)和菌絲形態(tài)的影響（10×40）Figure3 Effect of antifungal crude protein on spore germination and mycelial morphology of P.digitatum （10×40）

在抗菌蛋白提取方法的篩選過程中，曾采用了硫酸銨沉淀法，但是獲得的抗菌粗蛋白抗菌活性較低，而采用酸沉淀法獲得的抗菌粗蛋白具有較高的抗菌活性，說明該抗菌蛋白為小分子量蛋白。關(guān)于該抗菌蛋白的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定等工作有待于進一步研究。

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