長(zhǎng)沙青皮竹多糖脫蛋白質(zhì)方法研究

殷 凱 李湘洲 張 勝 王乙庚

YIN KaiLI Xiang－zhouZHANG ShengWANG Yi－geng

（中南林業(yè)科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

長(zhǎng)沙青皮竹 （Bambusatextilisvar.persistens.B.M.Yang）為湖南省優(yōu)良觀賞竹種［1］，原產(chǎn)地為湖南長(zhǎng)沙。竹葉中含有多種對(duì)人體有益的活性物質(zhì)，如黃酮、多糖、氨基酸和微量元素［2－4］。竹葉黃酮的生物活性和提取分離已經(jīng)有眾多學(xué)者進(jìn)行了研究報(bào)道［5－7］，竹葉多糖由于有增強(qiáng)機(jī)體免疫及抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化、降血糖和保護(hù)肝臟等作用，近年來(lái)也受到越來(lái)越多的關(guān)注。

研究多糖的生理活性，首先要獲得純度較高并具有天然活性的多糖［8］。然而，提取的多糖中通常會(huì)含有蛋白質(zhì)，影響多糖的純度，并使其藥理研究出現(xiàn)較大偏差［9］。在多糖的結(jié)構(gòu)鑒定、活性成分等研究環(huán)節(jié)往往需要較大量的粗多糖脫除蛋白質(zhì)操作，粗多糖中脫除蛋白質(zhì)的方法主要有Sevag試劑法［10］、三氯乙酸法［11］、生物酶法［12］、大孔樹(shù)脂法［13］以及聚酰胺吸附法［14］等，其中最常用的是Sevag試劑法和三氯乙酸法。生物酶法多采用蛋白質(zhì)酶降解多糖中的蛋白質(zhì)，但酶自身亦是蛋白質(zhì)，可能在脫除蛋白質(zhì)的同時(shí)又混入新的雜質(zhì)。方積年等［15］反對(duì)用大孔樹(shù)脂，認(rèn)為其適合分離小分子物質(zhì)，如果分離純化多糖易使多糖活性降低。

聚酰胺是由酰胺聚合而成的一類(lèi)高分子物質(zhì)，它對(duì)酚類(lèi)、醌類(lèi)及黃酮類(lèi)等富含酚羥基的化合物具有較強(qiáng)的吸附性能［16－18］，聚酰胺理化性質(zhì)穩(wěn)定，吸附選擇性獨(dú)特，使用周期長(zhǎng)，操作方便，不產(chǎn)生二次污染性質(zhì)，是一種友好型的分離方法。但總體而言，該方法應(yīng)用在多糖純化方面的報(bào)道還較少。在脫除多糖中游離蛋白質(zhì)方面，孟利等［14］曾用聚酰胺吸附法去除西藏靈菇胞外多糖發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，脫除率為81.59%，總糖回收率達(dá)到87.75%；張民［19］采用聚酰胺吸附法去除枸杞多糖中的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的含量下降到4.7%，枸杞多糖的回收率為98.7%。但是聚酰胺吸附法應(yīng)用于竹葉多糖的純化，尚未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。

本試驗(yàn)以長(zhǎng)沙青皮竹為研究對(duì)象，分別采用聚酰胺吸附法、三氯乙酸法、Sevag試劑法去除長(zhǎng)沙青皮竹葉多糖中的蛋白質(zhì)，以脫蛋白質(zhì)過(guò)程中多糖損失率和蛋白質(zhì)去除率作為衡量脫蛋白質(zhì)效果的考察指標(biāo)，為竹葉多糖的分離純化尋求適宜的蛋白質(zhì)脫除方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

長(zhǎng)沙青皮竹竹葉：2012年10月采集于中南林業(yè)科技大學(xué)竹園，經(jīng)該校林學(xué)院陳建華教授鑒定為長(zhǎng)沙青皮竹（Bambusatextilisvar.persistens.B.M.Yang）。竹葉自然風(fēng)干后，用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)20目篩，經(jīng)乙醇回流脫脂、熱水提取、醇沉離心、冷凍干燥即得青皮竹竹葉多糖。準(zhǔn)確稱(chēng)取適量竹葉多糖，用去離子水溶解，過(guò)濾除去不溶物，配制成5.0mg／mL多糖溶液備用。

1.1.2 儀器

冷凍干燥機(jī)：LGJ－10型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；

臺(tái)式高速離心機(jī)：TG16－WS型，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；

可見(jiàn)分光光度計(jì)：721N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 主要試劑

聚酰胺：柱層析用80～100目，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠；

考馬斯亮藍(lán)G－250：上海西塘生物科技有限公司；

其它試劑：均為市售分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Sevag試劑法脫蛋白質(zhì) 取3支試管，分別加入4mL粗多糖溶液，各滴加1mL Sevag試劑（氯仿∶正丁醇＝4∶1），恒 溫 （35 ℃）振 蕩 30min，4 000r／min 離 心15min，取上清液，再滴加1mL Sevag試劑，振蕩離心，重復(fù)操作4次，直至有機(jī)相與水相界面處不再出現(xiàn)白色膠狀物，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)及多糖的含量。

1.2.2 三氯乙酸法脫蛋白質(zhì) 取3支試管，分別加入4mL多糖溶液，各滴加4mL 3%三氯乙酸溶液，搖勻，于4℃冰箱中靜置12h，4 000r／min離心20min，取上清液，測(cè)定其蛋白質(zhì)及多糖的含量。

1.2.3 聚酰胺吸附法脫蛋白質(zhì) 聚酰胺去除雜質(zhì)后，準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0g，上柱壓實(shí)平整。將25mL多糖溶液經(jīng)過(guò)恒流泵注入柱床，靜置12h后，用5倍體積的去離子水洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至25mL，分別測(cè)定濃縮液中的蛋白質(zhì)與多糖含量。同時(shí)考察5.0，7.5，12.5，15.0g聚酰胺對(duì)多糖中蛋白質(zhì)的清除情況，平行試驗(yàn)3次。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 多糖含量的測(cè)定 采用苯酚－硫酸法［20］。在體積一致的前提下，多糖損失率計(jì)算公式見(jiàn)式（1）。

式中：

R1——多糖損失率，%；

c0—— 脫蛋白質(zhì)前溶液中多糖含量，mg／mL；

c1—— 脫蛋白質(zhì)后溶液中多糖含量，mg／mL。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法［21］。在體積一致的前提下，蛋白質(zhì)脫除率計(jì)算公式見(jiàn)式（2）。

式中：

R2——蛋白質(zhì)脫除率，%；

d0—— 脫蛋白質(zhì)前溶液中蛋白質(zhì)含量，mg／mL；

d1—— 脫蛋白質(zhì)后溶液中蛋白質(zhì)含量，mg／mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚酰胺用量對(duì)脫蛋白質(zhì)效果的影響

聚酰胺不同用量脫蛋白質(zhì)效果的比較見(jiàn)表1。由表1可知：聚酰胺的用量對(duì)于脫除竹葉粗多糖中蛋白質(zhì)的效果影響顯著。隨著聚酰胺用量的增加，洗脫液中所含的蛋白質(zhì)不斷降低，表明聚酰胺吸附蛋白質(zhì)的量呈增大趨勢(shì)；但在吸附蛋白質(zhì)的過(guò)程中，多糖損失率也呈增大趨勢(shì)。當(dāng)聚酰胺用量超過(guò)10.0g以后，蛋白質(zhì)脫除率的效果趨于平衡，而多糖損失率增加明顯。因此聚酰胺用量控制在10.0g為宜。由此也可推導(dǎo)出0.5mg／mL的多糖液與聚酰胺用量的最佳比例是25mL∶10.0g，即液固比為2.5∶1（V∶m）。

表1 不同質(zhì)量聚酰胺脫蛋白質(zhì)效果的比較Table1 Comparision about different quality of polyamide（n＝3）

2.2 3種方法脫除蛋白質(zhì)效果的比較

以2.1獲得的最佳聚酰胺用量，對(duì)青皮竹粗多糖進(jìn)行蛋白質(zhì)脫除，3種脫蛋白質(zhì)方法的效果比較見(jiàn)表2。由表2可知：從多糖損失率的角度而言，3種方法中三氯乙酸法處理后多糖損失率最大，Sevag試劑法多糖損失率最小。而從蛋白質(zhì)脫除效果考察，則三者蛋白質(zhì)脫除率依次為聚酰胺吸附法＞三氯乙酸法＞Sevag試劑法。

表2 3種脫蛋白質(zhì)方法的效果比較Table2 Comparision of three deproteinization methods（n＝3）

3 討論與結(jié)論

聚酰胺是一種吸附型色譜，它可以根據(jù)物質(zhì)中所含的氨基、羥基、氫鍵與共軛雙鍵的多少對(duì)物質(zhì)進(jìn)行吸附。一方面，由于蛋白質(zhì)分子中富含氨基和氫鍵，因此蛋白質(zhì)分子可以被聚酰胺吸附，并且去離子水不能將其從聚酰胺色譜柱上洗脫下來(lái)［14］；另一方面，雖然多糖是一種多羥基結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，但多糖易于形成分子內(nèi)氫鍵導(dǎo)致它與聚酰胺形成氫鍵的能力減弱［19］。因此，蛋白質(zhì)吸附在聚酰胺色譜柱上，而多糖則被去離子水洗脫下來(lái)，從而達(dá)到將多糖與蛋白質(zhì)分離的目的。

在以往多糖的分離純化過(guò)程中多采用Sevag法脫蛋白，但Sevag法往往要重復(fù)多次才能達(dá)到脫除蛋白質(zhì)的目的，且操作所使用的有機(jī)溶劑為氯仿、正丁醇等，對(duì)操作人員的安全有一定影響，而且萃取蛋白后的有機(jī)試劑無(wú)法完全回收使用，客觀上對(duì)環(huán)境也會(huì)產(chǎn)生一定的污染。三氯乙酸酸性較強(qiáng)，在使蛋白質(zhì)變性的同時(shí)也易使多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［22］，如果在此工藝下繼續(xù)純化多糖，還需對(duì)多糖溶液進(jìn)行中和，也會(huì)對(duì)多糖的鑒定造成局部影響。

而聚酰胺法在設(shè)定的條件下，一次脫除蛋白的效果就優(yōu)于Sevag試劑法和三氯乙酸法，并且聚酰胺可循環(huán)使用。同時(shí)，使用去離子水作為溶劑，對(duì)比其他方法使用有機(jī)溶劑或者酸性較強(qiáng)的溶劑而言，對(duì)操作人員和環(huán)境均無(wú)負(fù)面影響。因此聚酰胺脫蛋白質(zhì)是一種值得推廣的方法。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，聚酰胺在脫除蛋白的同時(shí)，對(duì)長(zhǎng)沙青皮竹多糖也有一定的影響，損失率為30.86%，且損失率隨著聚酰胺用量的增加而增加，較文獻(xiàn)［14］、［19］報(bào)道的西藏靈菇胞外多糖、枸杞多糖損失率都要高。推測(cè)長(zhǎng)沙青皮竹多糖中應(yīng)有部分多糖在結(jié)構(gòu)上綴有蛋白，導(dǎo)致聚酰胺對(duì)這部份多糖也有吸附作用，這一現(xiàn)象為今后開(kāi)展長(zhǎng)沙青皮竹多糖的結(jié)構(gòu)鑒定提供了一些研究思路，相關(guān)研究結(jié)果將另文報(bào)道。

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