不同產(chǎn)地苦丁茶多糖的提取

黃敏桃吳尤嬌黃云峰

HUANG Min－tao1，2WU You－jiao1，2HUANG Yun－feng3

賴茂祥3黃庶識(shí)1劉華鋼4

LAI Mao－xiang3HUANG Shu－shi1LIU Hua－gang4

（1.廣西科學(xué)院生物物理實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；3.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022；4.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021）

苦丁茶（IlexkudingchaC.J.Tseng）為冬青科冬青屬苦丁茶種常綠喬木，主要分布在廣西、廣東、福建等長(zhǎng)江以南地區(qū)［1］。苦丁茶含有三萜類、黃酮類、氨基酸、脂多糖和多種微量元素［2，3］等活性成分，是民間常用的中草藥和傳統(tǒng)的保健飲料。研究表明，植物多糖是一種多功能的活性物質(zhì)［4－7］?？喽〔瓒嗵鞘强喽〔柚饕钚猿煞?，具有抗氧化［8－10］、降血脂［11］及抗病原菌［12，13］等生物活性功能，有很好的應(yīng)用前景。前人［9－12］研究苦丁茶多糖均先提取粗多糖純化后再測(cè)定其提取率，純化過程中會(huì)流失一小部分多糖，而本研究直接測(cè)定提取液中的多糖含量，結(jié)果更接近藥材中的含量。結(jié)合文獻(xiàn)［8～13］研究多糖的一系列藥理作用與現(xiàn)代應(yīng)用，測(cè)定不同產(chǎn)地苦丁茶水提液中的多糖含量具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究以廣西、廣東、海南苦丁茶為研究對(duì)象，采用響應(yīng)面法優(yōu)化多糖最佳提取工藝，苯酚－硫酸法測(cè)定不同產(chǎn)地的多糖含量，為苦丁茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定及苦丁茶多糖藥物及功能性食品的開發(fā)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

苦丁茶：2011年7月至2012年8月采摘自不同產(chǎn)地的各種栽培及野生苦丁茶見表1，經(jīng)鑒定為冬青科冬青屬苦丁茶冬青 （IlexkudingchaC.J.Tseng），采回后晾干，粉碎，備用。

表1 苦丁茶不同產(chǎn)地樣品Table1 Ilex kudingcha C.J.Tsengsamples from different localities

1.1.2 試劑

濃硫酸：分析純，廉江市愛廉化試劑有限公司；苯酚：分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

試驗(yàn)用水：超純水，本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.3 儀器電子天平：BS224S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；雙光束紫外可見分光光度計(jì)：TU－1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；RE－52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

循環(huán)水式真空泵：SHB－B型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；超聲機(jī)：B3200S－T型，必能信超聲有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－8型，國(guó)華電器有限公司；

實(shí)驗(yàn)室超純水儀：OKP－S010型，上海淶科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)無水葡萄糖20.03mg，蒸餾水定容至100mL，再精密吸取10.00mL定容至50mL容量瓶中，得到40.06μg／mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取苦丁茶粉末5.000g，置于圓底燒瓶?jī)?nèi)，加蒸餾水至315mL，稱重，加熱回流120min，冷卻后加蒸餾水補(bǔ)足重量，將濾液稀釋20倍，備用。

1.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 以上述濃度的葡萄糖對(duì)照品溶液，按苯酚－硫酸法在200～800nm范圍內(nèi)掃描，選擇最大吸收波長(zhǎng)作為苦丁茶多糖的測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8mL 于試管中，并用水補(bǔ)足至2.0mL，得系列對(duì)照品溶液。分別加入1mL 6%苯酚溶液及5.0mL濃硫酸，待各管加完后搖勻，室溫靜置30min，482nm測(cè)吸光度，再精密吸取2.0mL蒸餾水，同法操作，作空白對(duì)照。以吸光度為縱坐標(biāo)（y），葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）提取溫度考察：稱取5g苦丁茶粉末，加入200mL蒸餾水，分別在溫度70，80，90，100℃下熱水浸提120min，提取3次，合并濾液濃縮，蒸餾水定容于10mL容量瓶中，得到供試品溶液。平行3次試驗(yàn)。按1.2.4的方法操作，在最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定，得到的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，根據(jù)換算公式得到總多糖含量。

（2）液料比考察：稱取5g苦丁茶粉末，分別加入200，250，300，350mL的蒸餾水，以最佳溫度提取120min，提取3次，合并濾液濃縮，其它操作同1.2.5（1）。

（3）提取時(shí)間考察：稱取5g苦丁茶粉末，以最佳提取溫度及液料比，分別提取90，120，150，180min，提取3次，合并濾液濃縮，其它操作同1.2.5（1）。

（4）提取次數(shù)考察：稱取5g苦丁茶粉末，以最佳提取溫度、液料比及提取時(shí)間，分別提取1，2，3，4次，合并濾液濃縮，其它操作同1.2.5（1）。

1.2.6 響應(yīng)面法對(duì)提取工藝的優(yōu)化 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)苦丁茶多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。得到最佳工藝再進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 不同產(chǎn)地樣品溶液的制備與測(cè)定 根據(jù)響應(yīng)面法得到的最佳提取工藝來制備來自不同產(chǎn)地的苦丁茶樣品溶液，再按1.2.4的方法進(jìn)行多糖含量測(cè)定。

1.2.8 樣品多糖含量計(jì)算 將測(cè)得的多糖吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成多糖中葡萄糖濃度C1，總多糖濃度換算公式見式（1）：

式中：

C—— 樣品中總多糖含量，mg／g。

C1—— 已稀釋樣品中換算出的葡萄糖濃度，μg／mL。

N——樣品稀釋倍數(shù)。

C2—— 樣品生藥濃度，g／mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

根據(jù)葡萄糖對(duì)照品溶液掃描結(jié)果，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)為482nm。

2.2 線性關(guān)系

采用苯酚－硫酸法測(cè)定一系列葡萄糖溶液的吸光度并繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y＝0.013 11x＋0.038 64，R2＝0.997 9，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線Figure1 Standard curve of glucose

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度、提取時(shí)間及液料比為試驗(yàn)因素（見表2），試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4、5。

表2 試驗(yàn)因素水平與編碼表Table2 Coding of experimental factors and levels

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Design and Results of Respons Surface Experiments

表4 回歸方程方差分析結(jié)果?Table4 Analysis of variance for the developed regression equation

表5 模型的可信度分析Table5 The credibility of the analysis model

采用Design Expert 7.1.6軟件進(jìn)行多元線性回歸擬合，得回歸方程Y＝73.98＋2.16A＋2.84B＋0.77C－6.71AB－3.99AC－0.23BC－5.55A2－3.04B2＋3.93C2。 方差分析結(jié)果表明，失擬項(xiàng)P＝0.123 5＞0.05，模型P＝0.004 5＜0.01，因此模型選擇正確。相應(yīng)的響應(yīng)面和等高線見圖2～4。

圖2中響應(yīng)面圖顯示，一定的液料比時(shí)，隨著提取溫度的升高，多糖含量越高；一定的提取溫度時(shí)，液料比的增大也有助于多糖的提?。挥傻雀呔€圖可知，在提取溫度為95℃、液料比為58∶1（V∶m）左右多糖濃度存在最大值?？赡艿脑蚴菧囟鹊纳呒铀俣嗵欠肿拥臄U(kuò)散解附作用，從而增加浸出率，液料比的增大使細(xì)胞內(nèi)外多糖的濃度差變大從而易于從細(xì)胞中溶出。

圖3響應(yīng)面圖顯示，提取時(shí)間一定時(shí)，提取溫度的增加促進(jìn)多糖浸出，在120min時(shí)溫度達(dá)到97.5℃左右具有較高的多糖含量，在180min時(shí)溫度95℃左右多糖含量較高，等高線圖可以看出兩種情況的多糖含量均在75mg／g以上?？紤]到時(shí)間過長(zhǎng)則可能破壞有效活性成分，在省時(shí)的情況下適當(dāng)提高溫度即可達(dá)到最大值，故選擇120min作為提取時(shí)間，97.5℃作為提取溫度。

圖2 提取溫度與液料比對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面與等高線Figure2 Response surface and contour plots for the effects of extraction temperature and liquid ratio on polysaccharide extraction yield

圖3 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面與等高線Figure3 Response surface and contour plots for the effects of extraction temperature and extraction time on polysaccharide extraction yield

由圖4響應(yīng)面曲線的彎曲程度說明液料比對(duì)多糖含量影響比提取時(shí)間顯著，液料比在63∶1（V∶m）左右多糖濃度高達(dá)78mg／g，在此液料比值之后多糖含量下降，證明合適的液料比有利于多糖浸出，可能的機(jī)理是液料比增大提高細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外的濃度差，促進(jìn)多糖分子向細(xì)胞外滲出，到一定的值之后，多糖浸出已達(dá)到最大值，溶劑量的增大則起到稀釋多糖濃度的作用，故多糖含量有所下降。

圖4 液料比與提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面與等高線Figure4 Response surface and contour plots for the effects of liquid ratio and extraction time on polysaccharide extraction yield

根據(jù)上述分析結(jié)果調(diào)整得出最佳工藝參數(shù)為提取時(shí)間120min，提取溫度98℃，液料比63∶1（V∶m）。平行3次實(shí)驗(yàn)，平均含糖量為 77.480mg／g，與理論預(yù)測(cè)值78.272mg／g相對(duì)誤差為1.02%，在可接受范圍內(nèi)。

2.4 苦丁茶多糖含量的測(cè)定

稱取不同產(chǎn)地苦丁茶樣品各5.0g，按上述最佳提取條件（提取溫度98℃、液料比63∶1（V∶m）、提取時(shí)間120min、提取3次）進(jìn)行多糖的提取，濾液稀釋20倍后再精密吸取2.0mL，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣方法操作，結(jié)果見表6。

由表6可知：

（1）不同產(chǎn)地整體對(duì)比中，廣西產(chǎn)地＞廣東產(chǎn)地＞海南產(chǎn)地。

表6 不同產(chǎn)地苦丁茶多糖含量Table6 Content of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J.Tsengfrom different localities（n＝3）

（2）比較海南和廣西7、8月份采集的樣品，海南苦丁茶多糖含量均比廣西苦丁茶多糖含量低，可能是海南氣候比較炎熱，增加多糖的消耗量。

（3）在同屬?gòu)V西產(chǎn)地中，大新縣的苦丁茶多糖含量最高；對(duì)于廣西本地苦丁茶不同的采收時(shí)間，7月份的多糖含量比12月份的高，可能是由于7月份陽光充足，而12月份氣候寒冷不利于植物合成多糖。

（4）野生品與栽培種相比較，栽培種的苦丁茶多糖含量明顯比野生品要高，栽培種在人工培養(yǎng)下所需要的生長(zhǎng)養(yǎng)料比野生的豐富，生長(zhǎng)環(huán)境較穩(wěn)定，從而利于多糖生成。

3 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)采用苯酚－硫酸法測(cè)定多糖含量，操作簡(jiǎn)單。在單因素考察的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法來對(duì)苦丁茶多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝為提取溫度98℃、液料比63∶1（V∶m）、提取時(shí)間120min、提取3次。

（2）不同產(chǎn)地其苦丁茶多糖含量具有顯著差異，以廣西天等、大新的含量最高，廣西苦丁茶多糖含量整體比廣東及海南的高。據(jù)《廣西萬承苦丁茶》一書記載：早在元朝期間就被指定為朝廷“貢茶”；《辭?！分杏小翱喽〔枵撸瑥V西特產(chǎn)茶也，產(chǎn)于萬承縣苦丁鄉(xiāng)”的記載（今大新縣龍門鄉(xiāng)苦丁村），廣西大新是廣西苦丁茶最主要的栽培基地，由此推斷大新?lián)碛懈诳喽〔枭L(zhǎng)的環(huán)境條件。試驗(yàn)結(jié)果顯示廣西大新的苦丁茶多糖含量與其他產(chǎn)地有顯著差別，結(jié)合前人［8－13］藥理試驗(yàn)結(jié)果，苦丁茶特異性多糖具有一系列的藥理活性，符合自古以來廣西大新苦丁茶為“正宗苦丁茶”的結(jié)論［1］。

（3）由于本研究所選樣品僅限于廣西、廣東及海南這3個(gè)省份，對(duì)其他省份地區(qū)苦丁茶樣品沒有采集，而且不同時(shí)間的樣品采集不齊全，具有一定的局限性，還需要進(jìn)一步的研究。

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