莪術(shù)油對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的影響及鉑類耐藥逆轉(zhuǎn)作用

李艷芳， 李 敏， 劉首娟， 孔德勝， 李榮霞， 史淑紅

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科，河北石家莊050000)

中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤是我國治療疾病的一大特色。近年來天然、低毒的中草藥也受到了國際上的關(guān)注［1-2］，莪術(shù)油是中藥莪術(shù)的主要提取物，近年來國內(nèi)外通過現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)油具有多種藥理作用，因而備受關(guān)注。隨著現(xiàn)代藥理研究的深入和各種制劑［3-4］的開發(fā)，莪術(shù)油在抗病毒方面［5-6］、免疫調(diào)節(jié)［7］、抗腫瘤方面［8-9］研究日益增多。在婦科方面，眾所周知的莪術(shù)油制劑保婦康栓廣泛應(yīng)用于臨床，其療效也得到臨床的肯定。在科學(xué)研究中也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)莪術(shù)油對宮頸癌細(xì)胞［8］、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞［9］有明顯的抑制作用，但是在在卵巢癌方面，尤其是在卵巢癌鉑類耐藥方面仍未見報道。

1 材料

人卵巢上皮癌細(xì)胞系SKOV3:由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所提供。人卵巢上皮癌順鉑耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP:購買于中國科學(xué)院腫瘤研究所。莪術(shù)油注射液:徐州萊恩藥業(yè)有限公司，規(guī)格:10 mL含莪術(shù)油0.1 g，國藥準(zhǔn)字H20067076。注射用順鉑 :齊魯制藥有限公司，規(guī)格:10 mg，國藥準(zhǔn)字H37021358。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢上皮癌細(xì)胞株SKOV3及順鉑耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP均于含10%胎牛血清(四季青無支原體優(yōu)級胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司)的RPMI 1640培養(yǎng)液 (GIBCO上海英俊生物有限公司)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2與相對飽和濕度。

2.2 MTT法測定莪術(shù)油對細(xì)胞增殖的抑制作用取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，以每孔約9×103細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔終體積為180μL加入不同質(zhì)量濃度的莪術(shù)油注射液20μL，終質(zhì)量濃度60、55、50、45、40、35、30 μg/mL，每個質(zhì)量濃度設(shè)6個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h后每孔避光加入20μL 5 mg/mL MTT溶液 (美國Sigma公司)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 mL DMSO(美國 Sigma公司)，輕微震蕩10 min，待紫色結(jié)晶充分溶解，于490 nm波長處分別測定吸光度OD值。按下列公式求出生長抑制率(IR)。并計算半數(shù)抑制濃度 (IC50)。細(xì)胞生長抑制率 =(1－實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%

2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測莪術(shù)油對細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞技術(shù)檢測莪術(shù)油對細(xì)胞周期的影響。對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，常規(guī)消化制備單細(xì)胞懸液，以每瓶1×106個細(xì)胞接種于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長同步后，吸去原培養(yǎng)液，加入含有莪術(shù)油的培養(yǎng)液4 mL，其中莪術(shù)油的濃度為其對SKOV3細(xì)胞的IC50，設(shè)空白對照組，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h和48 h終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞，70%冰乙醇固定，核糖核酸酶A(RnaseA，美國Sigma公司)處理，碘化丙啶 (PI，美國Sigma公司)避光染色60 min，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾后，流式細(xì)胞儀 (美國Beckmancouler-EPICSL)檢測細(xì)胞周期。采用增殖指數(shù)來表示細(xì)胞增殖狀態(tài)，即(S+G2)期的細(xì)胞數(shù)/總的細(xì)胞數(shù)。

2.4 莪術(shù)油對SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

2.4.1 順鉑對人卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞株的IC50取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，以每孔約9×103細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔終體積為180μL加入不同質(zhì)量濃度的用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液稀釋的順鉑20μL，終質(zhì)量濃度10、8、6、4、2、1μg/mL，每個質(zhì)量濃度設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后每孔避光加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄上清，加用DMSO，溶解紫色結(jié)晶，于490 nm波長測定吸光度OD值。計算生長抑制率 (IR)及IC50(具體同2.2項)。

2.4.2 2×2析因設(shè)計觀察莪術(shù)油對SKOV3/DDP細(xì)胞株順鉑耐藥性的影響。析因設(shè)計的兩因素:敏感細(xì)胞株SKOV3的莪術(shù)油IC50;敏感細(xì)胞株SKOV3的順鉑IC50。兩水平為有及無。實驗具體分組如表1所示。

表1 析因設(shè)計分組Tab.1 Groups of experiment

2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行處理，統(tǒng)計描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù) (四分位間距)表示，采用曲線擬合計算半數(shù)抑制濃度，細(xì)胞周期率的比較采用卡方檢驗，析因設(shè)計采用析因設(shè)計的方差分析。

3 結(jié)果

3.1 莪術(shù)油對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用 倒置顯微鏡觀察實驗組的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞較對照組減少，邊緣毛糙，不規(guī)則，胞質(zhì)顆粒感增強(qiáng)。隨著莪術(shù)油質(zhì)量濃度的增加，變化越明顯。48 h組較24 h組更明顯。

MTT比色結(jié)果顯示，莪術(shù)油注射液對人卵巢上皮癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，抑制率呈濃度和時間依賴性。抑制率隨著莪術(shù)油質(zhì)量濃度的增高而增加，作用時間48 h較24 h對細(xì)胞的抑制程度大。據(jù)莪術(shù)油質(zhì)量濃度對48 h抑制率作圖，符合二次回歸變化規(guī)律，R2=0.995，F(xiàn)=428.860，P＜0.01，曲線方程為 Y^=－2.443+0.121X－0.001X2計算莪術(shù)油對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50為33.71μg/mL。

3.2 莪術(shù)油對卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期的影響 實驗結(jié)果顯示無論是莪術(shù)油作用24 h，還是48 h，周期中各個時相的構(gòu)成較對照組均有明顯的變化。24 h組對照組G1期細(xì)胞比例為32.7%，而實驗組經(jīng)莪術(shù)油作用后增加至47.9%，相反S期細(xì)胞對照組51.8%降至32.5%，差別有統(tǒng)計學(xué)意義 (x2=367.002，P＜0.01)。48 h組變化趨勢于24 h組一致，即莪術(shù)油可以使SKOV3細(xì)胞G1期比例增加，而下調(diào)S期細(xì)胞比例，即莪術(shù)油可以將人卵巢癌SKOV3細(xì)胞阻滯于G0/G1期。但是24 h組和48 h組差別無顯著性。

增殖指數(shù)即S+G2期細(xì)胞的百分比，24 h組及48 h組均與對照組有明顯差別 (如表2)，此結(jié)果也說明了莪術(shù)油對SKOV3細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用。

表2 莪術(shù)油對SKOV3細(xì)胞增殖指數(shù)的影響Tab.2 Comparison of prdiferation index between G1 phase and(S+G2)phase in SKOV3 cell

3.3 莪術(shù)油對SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

3.3.1 順鉑對SKOV3/DDP細(xì)胞的IC50MTT比色法測得順鉑對SKOV3細(xì)胞系增殖抑制率隨順鉑質(zhì)量濃度的增加而增加，根據(jù)雙變量相關(guān)性分析，順鉑對SKOV3細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)對數(shù)函數(shù)關(guān)系(R2=0.961，F(xiàn)=99.672，P ＜0.01，Y^=13.169+34.921ln X)。計算 IC50為2.87μg/mL。

3.3.2 莪術(shù)油對SKOV3/DDP細(xì)胞株順鉑耐藥性的影響 各試驗組對SKOV3細(xì)胞的抑制率如表3所示，A組為66.01%，B組為3.74%，C組為49.75%，D組為0，差別具有顯著性，即A、B、C、D各組細(xì)胞的增殖狀態(tài)不全相同，(F=47.054，P＜0.01)。

表3 四組之間抑制率的比較Tab.3 Comprison of inhibition rate among four groups

析因設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，莪術(shù)油的主效應(yīng) (F=422.410，P＜0.01)、順鉑的主效應(yīng)(F=13.470，P＜0.01)及二者的交互效應(yīng) (F=5.283，P＜0.05)，即莪術(shù)油、順鉑均可抑制SKOV3細(xì)胞的增殖，二者合用對細(xì)胞生長的抑制有協(xié)同作用，莪術(shù)油可以增加耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性，交互作用圖見圖1所示，二者呈相交直線關(guān)系。

圖1 莪術(shù)油、順鉑交互作用圖Fig.1 Interactions plot of zedoary oil and cisplatin

4 討論

4.1 對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用 中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤是我國的特色之一，高效、低毒的天然中草藥越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的青睞。莪術(shù)為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujin Y．H．Chen et C．Ling的干燥根莖，性溫，味苦、辛，有破血祛瘀、行氣止痛之功效［10］。莪術(shù)油為莪術(shù)的非極性溶劑提取物所含的揮發(fā)油，其成分復(fù)雜，主要含有多種低沸點(diǎn)的倍半萜和單萜化合物［11］。近年國內(nèi)外通過藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)它是安全性很高的藥物，且具有藥理活性強(qiáng)、高效性等特點(diǎn)［12］，具有廣譜的抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血和抗氧化的活性［13］，其中抗腫瘤是莪術(shù)油最主要的藥理作用，對各細(xì)胞周期都有抑制作用［14-15］。這一點(diǎn)已經(jīng)在肝癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、鼻咽癌中得到證實。

本實驗結(jié)果表明莪術(shù)油對卵巢癌細(xì)胞的體外增殖有明顯的抑制作用，其抑制作用呈質(zhì)量濃度依賴性，這一結(jié)論與楊美春等［16］報道一致。從實驗結(jié)果可以看出，莪術(shù)油對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用隨莪術(shù)油質(zhì)量濃度的增加呈陡增性，莪術(shù)油質(zhì)量濃度為30μg/mL時其抑制率為20%左右，但是質(zhì)量濃度為40μg/mL其抑制率接近70%。經(jīng)計算得出莪術(shù)油對卵巢癌SKOV3細(xì)胞的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度34μg/mL。

4.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測莪術(shù)油對人SKOV3細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞周期一般分為G0、G1、S、G2、M時期，DNA的量也隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化。流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期是依據(jù)細(xì)胞DNA量來分析的。抗腫瘤藥物常通過抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成而發(fā)揮其抗腫瘤作用，它可以影響DNA合成過程的任何階段，受損的DNA常被阻滯在G1期而不進(jìn)入S期復(fù)制;或者被阻滯在G2期，從而阻斷其進(jìn)入M期進(jìn)行異常的有絲分裂［17］，長期的臨床實踐及實驗研究中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物與中藥聯(lián)合應(yīng)用提高臨床療效，但對其機(jī)制的了解還不夠深入［18-20］。

本研究結(jié)果顯示經(jīng)莪術(shù)油作用后，SKOV3細(xì)胞周期中各個時相的細(xì)胞所占的比例較對照組有明顯的變化，表現(xiàn)為G1期細(xì)胞比例均較對照組明顯增加，相應(yīng)的S期、G2期細(xì)胞比例明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，細(xì)胞周期呈明顯G1期阻滯狀態(tài)，也就是說莪術(shù)油可以將人卵巢上皮性惡性腫瘤SKOV3細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而阻斷細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞的增殖。增殖指數(shù)即S+G2期細(xì)胞的百分比，實驗結(jié)果顯示莪術(shù)油組明顯低于對照組(P＜0.01)，莪術(shù)油組的SKOV3細(xì)胞的增殖能力顯著低于對照組，進(jìn)一步證實了莪術(shù)油對人卵巢上皮性惡性腫瘤SKOV3細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用。

本實驗莪術(shù)油對SKOV3細(xì)胞周期的影響，在其作用24 h和48 h后差別不大，而本實驗中為了滿足流式細(xì)胞儀檢測樣本需要的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)的時候接種的細(xì)胞數(shù)量比較多，不排除在第二個24 h時，細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)很多，細(xì)胞營養(yǎng)相對不足，增殖能力下降的可能，從而不符合一般的生長曲線。這一現(xiàn)象有待進(jìn)一步證明。

4.3 SKOV3/DDP細(xì)胞株順鉑耐藥性的影響 腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的產(chǎn)生是卵巢癌復(fù)發(fā)、未控、轉(zhuǎn)移的主要原因，其產(chǎn)生機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，多年來的研究也未能完全闡明。細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生往往是多種機(jī)制共同參與，但是多年來對于多藥耐藥性的研究始終沒有找到滿意的藥物可以逆轉(zhuǎn)化療藥物的耐藥性。第一代MDR逆轉(zhuǎn)劑如鈣調(diào)節(jié)劑維拉帕米，可以通過競爭P-gp的結(jié)合位點(diǎn)從而增加藥物的敏感性，但是在體內(nèi)必須需要足夠的濃度才可以逆轉(zhuǎn)耐藥，這個濃度已經(jīng)超過了維拉帕米在體內(nèi)產(chǎn)生毒性的最小劑量，從而限制了其使用。第二代MDR逆轉(zhuǎn)劑由于干擾抗腫瘤藥物的藥代動力學(xué)也限制了使用［21］。由于耐藥機(jī)制的復(fù)雜性和多元性，化學(xué)藥物只能針對其中一種耐藥機(jī)制進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，而祖國的傳統(tǒng)中藥本身成分復(fù)雜，其治療腫瘤的特點(diǎn)也就具有多靶點(diǎn)、多層次、綜合調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，目前越來越多的學(xué)者目光轉(zhuǎn)向中草藥，并且已有研究表明許多中醫(yī)藥對耐藥細(xì)胞的凋亡有誘導(dǎo)作用，在中藥中篩選低毒、高效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑將成為腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑研究的一個新的方向［22-23］。李娟［24］的研究中也證實大黃素通過降低MDR-1、XIAP和Survivin的表達(dá)從而增加卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的藥物敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究采用2×2析因設(shè)計的實驗分組，分析了莪術(shù)油和順鉑聯(lián)合應(yīng)用之間的交互作用，結(jié)果表明二者合用對人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP的抑制作用存在交互作用，順鉑與莪術(shù)油合用可以增加二者對SKOV3/DDP細(xì)胞的抑制作用，由此可以認(rèn)為，莪術(shù)油可以增加細(xì)胞對順鉑的敏感性，換言之，莪術(shù)油在一定程度上可以改善人卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞株的順鉑抗藥性。但是關(guān)于莪術(shù)油在逆轉(zhuǎn)耐藥方面的作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

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