連花清瘟膠囊超聲逆流提取液超高效液相色譜指紋圖譜研究＊

李正杰，靳茂禮，張永鋒，粘立軍，武景路，劉敏彥

(1.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050035;2.石家莊市食品藥品檢驗所，河北 石家莊 050035)

連花清瘟膠囊系石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司自主研發(fā)并獲得國家專利的新藥，臨床證實其在防治SARS、禽流感、手足口病、甲型H1N1流感等嚴重公共衛(wèi)生事件中顯示出了良好的效果[1－3]。采用傳統(tǒng)的乙醇回流提取工藝，提取溶劑用量大，生產成本高，故采用連續(xù)超聲逆流提取技術對原工藝進行了優(yōu)化和提升，并采用超高效液相色譜(UPLC)法建立超聲逆流提取液的指紋圖譜[4－5]，為連花清瘟膠囊超聲逆流提取液質量控制標準的建立和評價提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Acquity UPLCHclass超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower3色譜工作站;AT201型1/10萬分析天平(瑞士 Mettlertoledo公司);Milli－QAdvantage A10超純水系統(tǒng)(millipore)。磷酸(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20120211);乙腈(色譜純，美國Fisher公司);水為超純水，其他試劑均為分析純。連花清瘟膠囊超聲逆流提取液(批號分別為S1:120327，S2:120401，S3:120402，S4:120403，S5:120404，S6:120405，S7:1200406，S8:120407，S9:120408，S10:120409，S11:120410);連翹酯苷A(批號為111810－201102)、連翹苷(批號為110821－201112)、大黃酸(批號為110757－200206)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院;松脂素－4－O－glc對照品為自制，經高效液相色譜分析純度大于95%。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:AcquityUPLC? BEHC18柱(100mm×2.1mm，1.7μm);檢測波長:228nm;進樣量:0.4μL;柱溫:40℃;流動相:乙腈 －0.1%磷酸溶液梯度洗脫，見表1。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 溶液制備

分別取連翹酯苷A、連翹苷、松脂素－4－O－glc、大黃酸對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成含連翹酯苷A 0.12 g/L、連翹苷 0.13 g/L、松脂素 －4－O －glc 0.09 g/L、大黃酸 0.10 g/L 的對照品溶液。按處方量取麻黃、連翹、大黃、魚腥草，加70%乙醇，浸泡20min，超聲逆流提取，取超聲逆流提取液，用0.22μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗:取同一樣品(批號為120327)的供試品溶液在擬訂色譜條件下重復進樣6次，記錄指紋圖譜。結果各色譜峰的相對保留時間的 RSD＜1.1%，相對峰面積的 RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:吸取同一供試品溶液，分別于 0，2，6，12，24 h 時進樣，測定峰面積。結果各色譜峰的相對保留時間的 RSD＜1.2%，相對峰面積的 RSD＜1.8%。綜合分析，超聲逆流提取液在常溫下24 h內穩(wěn)定。

重復性試驗:取同一樣品6份，依法制備供試品溶液，進行指紋圖譜分析。結果各色譜峰的相對保留時間的 RSD＜1.4%，相對峰面積的 RSD＜2.1%，表明該方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與相似度分析

指紋圖譜建立:取11批超聲逆流提取液，進行UPLC指紋圖譜測定，得相應的指紋圖譜，見圖1。并采用國家藥典委員會開發(fā)的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件對11批樣品的指紋圖譜進行分析，以S6為參照指紋圖譜(圖2)，采用平均數(shù)相關系數(shù)法對各指紋圖譜色譜峰進行多點校正和自動匹配，其中共有色譜峰27個，用標準品指認了其中4個共有峰，分別為連翹酯苷A(8號峰)、連翹苷(17號峰)、松脂素－4－O－glc(10號峰)、大黃酸(24號峰)，以出峰穩(wěn)定，峰面積較大的17號色譜峰－連翹苷為參照峰。

圖1 11批連花清瘟膠囊超聲逆流提取液UPLC指紋圖譜

圖2 連花清瘟膠囊超聲逆流提取液UPLC參照指紋圖譜(S6)

指紋圖譜相似度分析:將11批超聲逆流提取液的UPLC指紋圖譜導入國家藥典委員會2004年版“計算機輔助相似度評價系統(tǒng)”軟件中，并以S6為參照指紋圖譜(圖2)，采用平均數(shù)相關系數(shù)法對各指紋圖譜色譜峰進行了多點校正和自動匹配，生成連花清瘟膠囊超聲逆流提取液共有模式的對照指紋圖譜(R)，然后進行了相似度計算，11批超聲逆流提取液指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度見表2。

3 討論

表2 11批超聲逆流提取液指紋圖譜相似度表

對供試品溶液進行光譜檢測，比較各波長下的UPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)采用228 nm進行測定時，所得連花清瘟膠囊超聲逆流提取液所得圖譜信息量大，且峰值分布最合理，故確定波長為228 nm。

分別考察了超聲逆流30，45，60min時的樣品色譜圖，結果表明，超聲逆流45，60min樣品色譜圖中出峰相差不大，且峰面積較30min大，故超聲逆流時間確定為45min。

本試驗通過對超聲逆流提取液的研究，建立超聲逆流提取數(shù)據(jù)庫，利用UPLC快速檢測技術，實現(xiàn)了超聲逆流提取液的在線監(jiān)測，通過檢測結果，監(jiān)控超聲逆流提取過程，為保證不同批次產品之間的穩(wěn)定，提供了參考數(shù)據(jù)，實現(xiàn)了節(jié)能生產、高效生產。

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