山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的克隆及序列分析

劉洋 孫佳帝

低溫是經(jīng)常發(fā)生且危害嚴(yán)重的逆境因素之一，許多果樹在經(jīng)受低溫脅迫后都發(fā)生不同程度的傷害，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致整個(gè)植株死亡。近年來，在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)的CBF（C- repeat/ dehydration responsive element binding factor）低溫反應(yīng)途徑，使當(dāng)前果樹抗寒基因工程研究取得了重大突破。CBF轉(zhuǎn)錄因子能夠特異結(jié)合啟動(dòng)子中含有CRT/DRE 的順式元件，激活COR等基因的表達(dá)，從而提高植物的抗凍力［1，2］。本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)來自不同種屬的植物的低溫誘導(dǎo)基因CBF1的同源性進(jìn)行分析，以此為基礎(chǔ)克隆山葡萄低溫誘導(dǎo)基因CBF1，并對(duì)該基因的核苷酸序列及氨基酸序列進(jìn)行分析，旨在為下一步表達(dá)載體的構(gòu)建及基因轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院選育的兩性花山葡萄（Vitis amurensisRupr.）栽培品種“雙優(yōu)”。E.coli DH5α、表達(dá)質(zhì)粒pBI121由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院提供。克隆載體pMD18-T vector、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶及其他工具酶購自寶生物工程（大連）有限公司；DEPC、Tris等RNA提取試劑、植物基因組DNA小量提取試劑盒、切膠回收試劑盒、DNA清潔試劑盒、DNA Marker DL2000購自杭州維特潔生化技術(shù)公司。引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成，序列測(cè)定用測(cè)序儀ABIPRISMTM377DNA Sequence進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 山葡萄葉片組織中總RNA的提取 以水培法培養(yǎng)山葡萄（Vitis amurensisRupr.）枝條，待枝條長出3-5片真葉時(shí)進(jìn)行4℃低溫處理4h，采用CTAB法（操作方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第3版）提取山葡萄葉片組織總RNA。

1.2.2 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因中間片段的分離

取 5μL（≤2μg）mRNA，2μL 反轉(zhuǎn)錄酶，4μL buffer（5×），2μL dNTP mix（10mmol/L），0.5μL RNase Ribonuclease Inhibitor，3.5μL DEPC 水，70℃ 水浴變性5min，冰浴5min稍離心，慢慢混勻后，低速離心，收集液滴，42℃溫浴60min，85℃加熱10min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，得到cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20μL的體系包括0.5μL cDNA，2μL buffer（10×），2μL Mg2+（25mmol/L），0.25μL dNTP（10mmol/L），0.5μL P1，0.5μL P2，0.25μL Taq 酶（5U/μL），14μL ddH2O，擴(kuò)增引物見表 1。擴(kuò)增程序如下：95℃溫育15min后，進(jìn)入熱循環(huán)，第 1 個(gè)循環(huán)參數(shù)為 94℃ 45s，68℃ 30s，72℃ 30s，此后每個(gè)循環(huán)的退火溫度下降1℃，共計(jì)9 個(gè)循環(huán)，然后以94℃ 45s，56℃→ 61℃ 30s，72℃30 s梯度PCR 方式運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸8min 結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳回收后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在Amp平板上挑取重組質(zhì)粒，PCR鑒定后送至大連寶生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 反向PCR方法分離山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因側(cè)翼序列 根據(jù)1.2.2分離出來的CBF1基因中間片段，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異引物（ViCBF1-F1、 ViCBF1-R1及ViCBF1-F2、ViCBF1-R2），見表1。用植物基因組DNA小量提取試劑盒（見說明書）提取山葡萄基因組DNA，應(yīng)用一種在已知序列及側(cè)翼的未知區(qū)域中沒有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶HindⅢ消化，消化體系 40μL，包括HindⅢ（30U）2μL，Buffer（10×）4μL，BSA（0.1％）4μL，DNA 20μL（1.5μg），dd-H2O 10μL，65℃處理18-20min，滅活內(nèi)在的限制性內(nèi)切酶。純化回收DNA樣品（用DNA清潔試劑盒），具體操作方法按照說明書進(jìn)行，利用回收的DNA樣品作為反向PCR的模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳分離，回收目的片段進(jìn)行克隆測(cè)序。

1.2.4 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因全長DNA及cDNA的克隆 根據(jù)方法2.3得到的山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的側(cè)翼序列，在其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物（ViCBF1-F3 、ViCBF1-R3），見表 1。以山葡萄基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳分離，回收目的片段進(jìn)行克隆測(cè)序。

在ViCBF1基因的ORF設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物（ViCBF1-F4 、ViCBF1-R4）（表 1）。以反轉(zhuǎn)錄 cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得山葡萄CBF1基因的全長cDNA 序列。

表1 克隆CBF1基因所用引物

1.2.5 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的序列分析 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因序列相似性比較在http：//ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上用BLAST進(jìn)行，根據(jù)目的基因核苷酸序列用Primer 5.0軟件推導(dǎo)出目的基因的氨基酸序列，并進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果

2.1 山葡萄總RNA的提取與mRNA的分離

山葡萄植物細(xì)胞中含酚類化合物，并且多糖含量比較高，為此在本試驗(yàn)在CTAB原方法的基礎(chǔ)上增加PVP（聚乙烯吡咯烷酮）含量，因?yàn)镻VP中的CO-N=基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚化合物的能力，能有效地去除多酚對(duì)RNA提取的干擾，從而獲得純度較高的山葡萄RNA，如圖1所示，23S 核糖體RNA 與18S核糖體RNA 的帶型清晰銳利，它們的亮度比基本上呈2∶1 關(guān)系，不存在蛋白質(zhì)、多糖和酚類物質(zhì)的明顯干擾。

2.2 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因中間片段及側(cè)翼序列的獲得

以mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行電泳，通過PCR獲得cDNA的擴(kuò)增片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物重組到pMD18-T克隆載體上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果為758bp。根據(jù)序列信息，設(shè)計(jì)兩對(duì)側(cè)翼序列嵌套引物，反向PCR獲得一長度約為750bp的片段（圖2）；測(cè)序結(jié)果為753bp（圖3）所示，其中有546bp是與上述已經(jīng)分離出來目的基因中間片段的重疊區(qū)域（圖3中的陰影部分即是）。圖3中的方框部分是新擴(kuò)增出來的片段，長度為206bp，雙下劃線部分的6bp是HindⅢ酶切位點(diǎn)，HindⅢ的實(shí)際酶切位點(diǎn)是AAGCTT，而在本試驗(yàn)中由于此酶產(chǎn)生了星號(hào)活性，此位點(diǎn)變?yōu)锳TGCTT（雙下劃線），剩余的200bp新擴(kuò)增出來的片段，其中有94bp是目的基因的5'端片段（即方框中雙下劃線右側(cè)序列，106bp目的基因的3'端片段（即方框中雙下劃線左側(cè)序列）。

圖1 4℃低溫處理4h山葡萄的RNA的提取

圖2 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖3 反向PCR測(cè)序結(jié)果

2.3 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因全長DNA及 cDNA的克隆

以山葡萄基因組DNA為模板，引物ViCBF1-F3、ViCBF1-R3（表1）。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物比較特異，無雜帶，無降解現(xiàn)象（圖4）。以山葡萄mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行電泳，引物ViCBF1-F4、ViCBF1-R4（表1），PCR獲得cDNA的擴(kuò)增片段，如圖5所示。測(cè)序結(jié)果所得到的序列與我們用基因組擴(kuò)增所得到的序列在編碼區(qū)內(nèi)完全一致，這說明山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因在編碼區(qū)內(nèi)沒有內(nèi)含子。與所報(bào)道的其他植物中CBF1基因在編碼區(qū)內(nèi)沒有內(nèi)含子的結(jié)論完全一致。過程受此區(qū)域的控制。位于C末端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)酸性氨基酸含量較高，位于第237-251個(gè)氨基酸之間，其pI在3.6-3.9之間，這一區(qū)域在轉(zhuǎn)錄激活中起主要作用。

圖4 目的基因全長的PCR分析

圖5 目的基因的cDNA克隆的PCR產(chǎn)物

2.4 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列分析

山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因序列全長為910bp，編碼區(qū)長為753bp，無內(nèi)含子。山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列，如圖6所示。CBF1轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子，其一級(jí)結(jié)構(gòu)中含有AP2 DNA結(jié)合域（圖6中的陰影部分），它由79個(gè)氨基酸殘基組成，在不同的植物中非常保守，山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因與其他幾種植物中的CBF1基因的同源性主要?dú)w因于它們的AP2 DNA結(jié)合域的高度同源。預(yù)測(cè)的堿性核定位信號(hào)位于N末端區(qū)域，位于第36-75個(gè)氨基酸之間，富含精氨酸和賴氨酸，CBF1轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核的

圖6 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1的核苷酸序列及其相應(yīng)的氨基酸序列

2.5 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的氨基酸序列分析

根據(jù)開放閱讀框的密碼子翻譯，推測(cè)該基因編碼一個(gè)含有251個(gè)氨基酸的多肽，分子量約為27.503kD，等電點(diǎn)偏低，pI=3.11，屬酸性蛋白。

表2 氨基酸成分組成成分

通過氨基酸組成分析得知，山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因中絲氨酸的濃度較高，達(dá)到13.55％，而堿性氨基酸賴氨酸和精氨酸的濃度分別為6.37％和6.77％，酸性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸的濃度分別為5.58％和6.77％（表2）。

2.6 山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因氨基酸序列比較

Blast軟件分析表明，山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因與其他幾種植物的CBF1有著很高的相似性，其中與茄科辣椒屬中的簇生椒（Capsicum annuum）、鹽芥（Thellungiella salsuginea）、橡膠樹（Heavea brasiliensis）、葡萄（Vitis vinifera）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）蘋果（Malus×domestica）、大麥（Hordeum vulquare）、馬藺（Iris lactea var. chinensis）等植物的CBF1基因的氨基酸同源性達(dá)到80.7％。如圖7所示，在不同植物中AP2/EREBP區(qū)域內(nèi)是高度保守的，它含有1個(gè)由約60-70個(gè)氨基酸殘基組成的非常保守的DNA結(jié)合域（DNA-binding domain），主要功能是調(diào)節(jié)低溫、干旱、高鹽等脅迫條件下的應(yīng)答反應(yīng)。而且在AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的上游和下游分別有兩段保守序列，即PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR，在預(yù)測(cè)由擬南芥編碼產(chǎn)生的140多種 AP2/EREBP域蛋白中，只有CBF1、CBF2和CBF3才具有這兩段短多肽序列，因而稱其為CBF蛋白的特征序列，而在AP2/EREBP區(qū)域的兩側(cè)氨基酸序列總體上看沒有明顯的同源性。

圖7 十種植物低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的氨基酸序列比較

3 討論

近 3年來，在擬南芥［3］、油菜［3］、水稻［4］和番茄［5］等植物中發(fā)現(xiàn)了CBF1轉(zhuǎn)錄激活因子，本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)所能獲得的低溫誘導(dǎo)植物的CBF1基因序列進(jìn)行了系統(tǒng)分析，進(jìn)而獲得了不同低溫誘導(dǎo)植物的CBF1基因的共同結(jié)構(gòu)域，藉此合成兼并引物，并以山葡萄葉片組織為材料，采用RT-PCR和反向PCR技術(shù)成功獲得了山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因，在GenBank上的登錄號(hào)為DQ517296，并采用Blast軟件分析對(duì)大麥（Hordeum vulquare）、水稻（Oryza sativa）等10種低溫誘導(dǎo)植物的CBF1基因的氨基端序列進(jìn)行了比對(duì)，其同源性達(dá)到80.7％，這也說明基因進(jìn)化的保守性。該研究的核心技術(shù)在于：兼并引物的設(shè)計(jì)及兼并引物條件下PCR條件的設(shè)置。該方法與慣常使用的同源序列法的不同點(diǎn)在于以大量低溫誘導(dǎo)植物的CBF1基因的相似性為基礎(chǔ)，采用梯度PCR方法，無須要求引物序列的完全匹配，對(duì)同源性的要求較低。此外，本研究采用反向PCR的方法一次性獲得目的基因的側(cè)翼序列即非編碼區(qū)部分，該方法只需要提取基因組DNA進(jìn)行單酶切和自身環(huán)化，從而簡化了分離未知基因的步驟。

比較分析現(xiàn)有的低溫誘導(dǎo)的植物CBF1基因序列發(fā)現(xiàn)，CBF1基因中含有高度保守的AP2/EREBP結(jié) 構(gòu) 域［6，7］，AP2/EREBP 家 族 的 轉(zhuǎn) 錄 因 子 是 與環(huán)境脅迫應(yīng)答反應(yīng)等有關(guān)的一系列轉(zhuǎn)錄因子。在山葡萄AP2/EREBP域的上游和下游存在PKK/RPAGRxKFxETRH和DSAWR特征序列，在擬南芥［8］編碼產(chǎn)生的140多種AP2/EREBP域蛋白中，只有CBF1、CBF2、CBF3才具有這兩段短多肽序列，兩序列在進(jìn)化程度不同的物種［9，10］中保守存在。因此，推測(cè)這兩段序列為CBF蛋白的特征序列，在CBF基因抗寒性功能研究中發(fā)揮非常重要的作用。結(jié)合本研究的結(jié)果及CBF1同源基因研究方面的文獻(xiàn)，可以推測(cè)這樣一種可能：即存在一種和CBF 蛋白相似的蛋白質(zhì)與編碼去飽和酶的基因的啟動(dòng)子中某一元件結(jié)合，促進(jìn)編碼去飽和酶的基因的表達(dá)，去飽和酶使膜脂的不飽和度增加，從而最終增加膜脂在低溫條件下的流動(dòng)性和穩(wěn)定性，增強(qiáng)植物的抗寒力。

4 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了一對(duì)兼并引物，采用RT-PCR及反向PCR技術(shù)克隆了山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因全長，其ORF長為753bp，無內(nèi)含子。經(jīng)序列比較分析，該基因?qū)儆贏P2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子，其一級(jí)結(jié)構(gòu)中含有AP2DNA結(jié)合域，它由79個(gè)氨基酸殘基組成，在不同的植物中較保守。

［1］Thomashow MF, Gilmour SJ, St ockinger EJ, et al. Role of theArabidopsisCBF transcriptional activators in cold acclimation［J］. Physiol Plant, 2001, 112：171-175.

［2］Gilmour SJ, Zarka DG, Stockinger EJ, et al. Low temperature regulation of theArabidopsisCBF family of AP2transcriptional activator as an early step in cold-induced COR gene expression［J］. Plant J,1998, 16（4）：433-442.

［3］Jaglo KR, Kleff S, Amundsen KL, et al. Components of theArabidopsisC-repeat/dehydration element binding factor cold-response pathway are conserved inBrassica napusand other plant species［J］.Plant Physiol, 2001, 127：910-917.

［4］Dubouzet JG, Sakuma Y, Ito Y, et al. OsDREB genes in rice, Oryza sativaL.encode transcription activators that function in drought-,high-salt-and cold-responsive gene expression［J］. Plant J, 2003,13（5）：356-359.

［5］Hsieh TH, Lee JT, Charng YY, et al. Tomato plants ectopically expressingArabidopsisCBF 1 show enhanced resistance to water deficit stress［J］. Plant Physiology, 2002, 130：618-626.

［6］Riechmann JL, Meyerowitz EM. The AP2/EREBP family of plant transcription factors［J］. Biol Chem, 1998, 379：633-646.

［7］Okamuro JK, Caster B, Villarroel R, et al. The AP2domain of APETALA2defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis［J］. Proc Natl Acad SciUSA, 1997, 94：7076-7081.

［8］Kanaya E, Nakajima N, Morikawa K, et al. Characterization of the transcriptional activator CBF1 fromArabidopsis thaliana：evidence for cold denaturation in regions outside of the DNA binding domain［J］. Biol Chem, 1999, 274（23）：16068-16076.

［9］Novillo F, Alonso JM, Ecker JR, et al. CBF2/DREB1C is a negative regulator of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A expression and plays a central role in stress tolerance inArabidopsis［J］. Proc Natil Acad SciUSA, 2004, 101（11）：2985-2990.

［10］Gilmour SJ, Sebolt AM, Salazar MP, et al. Overexpression of theArabidopsisCBF3transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation［J］. Plant Physiology, 2000, 124：1854-1865.