退黃丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

于紅艷， 許成剛， 崔永霞

(1.河南省中醫(yī)院，河南鄭州450002;2.河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450008)

退黃丸是由綿茵陳、梔子、葛根、大黃、赤芍、秦皮等多味中藥粉碎成細(xì)粉，過篩，混勻，用水泛丸，干燥制得。具有清熱利濕，化瘀通腑，利膽退黃之功效。用于治療急慢性肝炎，肝硬化，重癥肝炎屬濕熱證者。本方為醫(yī)院制劑，應(yīng)用于臨床已久，療效顯著，為進(jìn)一步控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，采用HPLC法對其君藥綿茵陳的有效成分綠原酸、梔子有效成分梔子苷、葛根有效成分葛根素、赤芍有效成分芍藥苷、大黃有效成分大黃酸及其秦皮有效成分秦皮甲素和秦皮乙素都進(jìn)行定量測定［1］，方法快速、準(zhǔn)確、簡便。并建立了大黃中大黃酸、葛根中葛根素、赤芍中芍藥苷、秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素［2-7］的薄層色譜［7］鑒別，結(jié)果滿意，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 樣品、儀器與試藥

1.1 樣品來源 退黃丸 (河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，批號20100309、20100310、20100311)，粉碎成細(xì)粉。

1.2 儀器與試劑 戴安高效液相色譜儀;Agilent C18色譜柱 (250mm×4.6mm，5μm)柱;十萬分之一電子天平 (AE240);色譜級甲醇、乙腈 (天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司);雙蒸水自制;其他試劑均為分析純。綠原酸 (批號 110753-200212);梔子苷 (批號110749-200714);葛根素(批號 110752-200511);大黃酸 (批號 0757-200206);芍藥苷 (批號110736-201035);秦皮甲素 (批號0757-200206);秦皮乙素 (批號110752-200511);大黃對照藥材 (批號902-8903);赤芍對照藥材 (批號121093-200405);秦皮對照藥材(批號 908-8904);葛根對照藥材 (批號20100506)，以上藥材均來自中國藥品生物制品檢定所。

2 定性鑒別

2.1 大黃的鑒別 取退黃丸粉末1.7 g，加入甲醇20 mL，微波超聲20 min，過濾，揮干濾液，殘渣加水5mL溶解，加鹽酸0.5 mL，恒溫水浴加熱30 min，冰水冷卻，乙醚液萃取2次，每次用量10 mL，蒸干合并的乙醚液，殘渣用三氯甲烷1 mL溶解，作為供試品溶液。另取大黃對照藥材0.1 g和缺少大黃的陰性對照粉末1.6 g，同種方法制成大黃對照藥材溶液及缺大黃的陰性對照溶液，再取大黃酸對照品，甲醇溶解制成1 mg/mL的大黃酸對照溶液。照薄層色譜法試驗，吸取4種上述溶液各3μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，配制甲酸-甲酸乙酯-石油 (60～90℃)(1∶5∶15)，取上層液為展開劑展開，取出，晾干，置密閉容器中氨蒸氣熏，觀察斑點。退黃丸溶液色譜中，在與對照品及對照藥材色譜相應(yīng)位置上，有相同斑點，而陰性色譜對照位置中無此斑點。見圖1。

圖1 大黃的TLC鑒別圖Fig.1 TLC chromatogram of Rhei Radix et Rhizoma

2.2 葛根鑒別 取退黃丸16.5 g研細(xì)，加20 mL甲醇，靜置2 h后濾過，濾液恒溫水浴蒸干，加甲醇1 mL使殘渣溶解，作為供試品溶液。另取葛根藥材0.8 g及缺葛根的陰性對照藥材粉末15.7 g，同一制備方法制成對照藥材溶液及陰性對照溶液。再取葛根素對照品，加甲醇溶解，制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，取上述4種溶液各2μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，用甲醇-三氯甲烷-水 (2∶7∶0.5)展開，取出，晾干，放置紫外光燈 (365 nm)下觀察斑點。供試品色譜中，在與對照品及對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，有相同顏色的斑點，而陰性色譜對照位置中無此斑點。見圖2。

圖2 葛根的TLC鑒別圖Fig.2 TLC chromatogram of Puerariae lobatae Radix

2.3 秦皮的鑒別 取退黃丸粉末17 g，置圓底燒瓶中，加分析甲醇30 mL，回流提取10 min，放冷，濾過，濃縮至2 mL作為供試品。另取秦皮對照藥材1 g和缺秦皮的陰性對照藥材粉末16 g，同種方法制成對照藥材溶液及陰性對照溶液，再取秦皮甲素及秦皮乙素對照品，加甲醇制成每2 mg/mL的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各4μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，用三氯甲烷-甲酸-甲醇 (6∶0.5∶1)展開，取出，晾干，紫外光燈 (254 nm)觀察斑點，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜有相同顏色的斑點。而陰性色譜在此對照位置無斑點。見圖3。

2.4 赤芍的鑒別 取赤芍藥材粉末2.6 g，酒精10 mL振搖提取5 min，過濾后蒸干，加2 mL酒精溶解殘渣，為供試品溶液。另取赤芍對照藥材0.4 g和缺赤芍的陰性對照藥材粉末2.2 g，同一方法制備赤芍對照藥材溶液及缺赤芍陰性對照溶液，芍藥苷對照品加酒精溶解成2 mg/mL的對照品溶液。按照薄層色譜法試驗，吸取4種制備溶液各3μL，點于硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲酸-甲醇-乙酸乙酯 (40∶0.2∶10∶5)為展開劑，展開，以5%香草醛硫酸溶液為顯色劑，加熱至斑點顯色清晰，與對照藥材色譜和標(biāo)準(zhǔn)對照品色譜對比，相同位置有相同顏色的斑點。但是陰性色譜對照液在此位置則沒有相同顏色的此斑點。見圖4。

圖3 秦皮的TLC鑒別圖Fig.3 TLC chromatogram of Fraxini Cortex

圖4 赤芍的TLC鑒別圖Fig.4 TLC chromatogram of Paeoniae Radix rubra

3 定量測定

3.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱均為Agilent C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm);柱溫均為30℃;體積流量均為1 mL/min。

綠原酸和梔子苷:流動相B為甲醇，流動相A為0.05%磷酸水溶液作為流動相，梯度洗脫，在0～15min，B相保持17%不變，15～30min，B相從17%線性改變至25%，30～45 min，B相從25%線性改變至17%，45～55min，B相保持17%10 min;檢測波長為245 nm;理論板數(shù)按綠原酸峰及其梔子苷峰計算不低于3 000。

葛根素:流動相為甲醇-水 (25∶75);檢測波長為250 nm;理論板數(shù)按葛根素峰計算不低于4 000。

芍藥苷:流動相B為甲醇，流動相A為0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液作為流動相，梯度洗脫，在0～10 min，B相從比例25%改變至30%，10～20 min，B相從比例30%改變至38%;檢測波長為230 nm;理論板數(shù)按芍藥苷峰計算不低于3 000。

大黃酸:流動相為甲醇-0.1%磷酸水 (85∶15);檢測波長為254 nm;理論板數(shù)按葛根素峰計算不低于3 000。

秦皮甲素和秦皮乙素:流動相B為乙腈，流動相A為0.1%磷酸水為流動相，梯度洗脫，在0～30 min，B相從比例5%改變至30%，30～35 min，B相保持30%不變;檢測波長為334 nm;理論板數(shù)按秦皮乙素峰計算不低于5 000。

3.2 對照品溶液的制備 分別取綠原酸、梔子苷、葛根素、芍藥苷、大黃酸、秦皮甲素和秦皮乙素對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL含綠原酸、梔子苷、葛根素、芍藥苷、大黃酸、秦皮甲素和秦皮乙素分別為126μg、131.6μg、50μg、53.4 μg、17.2μg、24.8μg、42.0μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備

綠原酸及梔子苷:取退黃丸藥材研細(xì)，精密稱定5.0 g，置具塞錐形瓶中，精密量取100 mL 50%甲醇，密塞，稱量，超聲處理30 min(功率250W，頻率60 Hz)，放冷，再稱定，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

葛根素:取退黃丸藥材研細(xì)，精密稱定2.0 g，置具塞錐形瓶中，精密量取30%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，在稱定質(zhì)量，用30%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

芍藥苷:取退黃丸藥材研細(xì)，精密稱定2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，浸泡4 h，超聲處理20 min(功率250 W，頻率60 Hz)，放冷，再稱定，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

大黃酸:取退黃丸藥材研細(xì)，精密稱定2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率60 Hz)，放冷，再稱定，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

秦皮甲素及秦皮乙素:取退黃丸藥材研細(xì)，精密稱定8.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 線性關(guān)系的考察 精密量取3.2項制備項下綠原酸及梔子苷混合對照品溶液2、4、6、8、10 mL，50%甲醇定容至10 mL;按色譜條件測定;以峰積分面積 (Y)為縱坐標(biāo)，樣品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為綠原酸Y=0.264 8X－2.923 7(r=0.999 95);梔子苷Y=0.300 1X－3.402 3(r=0.999 95)，結(jié)果表明綠原酸在0.025 2～0.126 mg/mL，梔子苷在0.026 32～0.131 6 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密量取3.2項制備項下葛根素、芍藥苷、大黃酸對照品溶液2、4、6、8、10 mL，甲醇定容至10 mL;按色譜條件測定;以峰積分面積 (Y)為縱坐標(biāo)，樣品質(zhì)量濃度 (X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為葛根素 Y=45.864X－13.658(r=1.000 0);芍藥苷Y=136.19X－98.654(r=0.999 7);大黃酸 Y=48.633X－19.322(r=1.000 0)結(jié)果表明葛根素在0.010 00～0.050 00 mg/mL、芍藥苷在0.010 68～0.053 40 mg/mL、大黃酸在0.003 44～0.017 20mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密量取3.2項制備項下秦皮甲素和秦皮乙素混合對照品溶液1、2、4、8、10 mL甲醇定容至10 mL，按色譜條件測定;以峰積分面積 (Y)為縱坐標(biāo)，樣品質(zhì)量濃度 (X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為秦皮甲素Y=66.966X－124.45(r=1.0);秦皮乙素Y=87.981X－141.33(r=0.999 7);結(jié)果表明秦皮甲素在0.002 48～0.024 8 mg/mL、秦皮乙素在0.004 2～0.042 0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4.2 精密度試驗 精密吸取上述同一對照品溶液8μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄所得峰面積，綠原酸、梔子苷、葛根素、芍藥苷、大黃酸、秦皮甲素和秦皮乙素 RSD值分別為0.20%、0.16%、0.33%、0.14%、0.51%、0.47%和 0.29%，表明該儀器精密度良好。

3.4.3 穩(wěn)定性試驗 分別精密吸取不同制備方法的供試品溶液10μL，分別在0、4、8、12、16h測定綠原酸和梔子苷、葛根素、芍藥苷、大黃酸、秦皮甲素和秦皮乙素峰面積，RSD值分別為1.31%、 1.58%、 1.03%、 1.77%、 1.19%、0.98%、1.67%，表明7種成分12 h穩(wěn)定。

3.4.4 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號供試品樣品適量共6份，按3.3項下的方法制備供試品溶液，平行進(jìn)行測定，每次進(jìn)樣10μL，記錄綠原酸和梔子苷、葛根素、芍藥苷、大黃酸、秦皮甲素和秦皮乙素的峰面積，RSD值分別為1.26%、1.39%、 2.06%、 1.97%、 1.76%、 2.22%、1.53%，表明該方法的重復(fù)性良好。

3.4.5 加樣回收率試驗

綿茵陳及梔子:取已知綠原酸和梔子苷量的制劑樣品 (批號20100310)6份，每份約2.5 g，精密稱定，精密加入一定質(zhì)量濃度的混合對照溶液，用上述制備供試品方法制備，作為加樣回收供試品溶液。

葛根:取已知葛根素量的制劑樣品 (批號20100310)6份，每份約1.0 g，精密稱定，精密加入一定質(zhì)量濃度的葛根素對照溶液，用上述制備供試品方法制備，作為加樣回收供試品溶液。

赤芍:取已知芍藥苷量的制劑樣品 (批號20100310)6份，每份約1.25 g，精密稱定，精密加入一定質(zhì)量濃度的芍藥苷對照溶液，用上述制備供試品方法制備，作為加樣回收供試品溶液。

大黃酸:取已知大黃酸量的制劑樣品 (批號20100310)6份，每份約1.25 g，精密稱定，精密加入一定質(zhì)量濃度的大黃酸對照溶液，用上述制備供試品方法制備，作為加樣回收供試品溶液。

秦皮:取已知秦皮甲素和秦皮乙素量的制劑樣品 (批號20100310)6份，每份約4.0 g，精密稱定，精密加入一定質(zhì)量濃度的混合對照溶液，用上述制備供試品方法制備，作為加樣回收供試品溶液。

將上述配制的供試品溶液每次精密進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行測定，綠原酸、梔子苷、葛根素、芍藥苷、大黃酸、秦皮甲素和秦皮乙素的平均回收率分別 為 98.80%、99.38%、99.12%、98.70%、98.72%、100.71%、98.85%;RSD 分 別 為1.18%、 0.95%、 1.56%、 2.11%、 1.65%、0.65%、2.01%(n=6)，見表1～3。

表2 葛根素、芍藥苷和大黃酸的回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.2 Results for recovery tests of puerarin，paeoniflorin and rhein(n=6)

表3 秦皮甲素、秦皮乙素的回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.3 Results for recovery tests of aesculin and aesculetin(n=6)

3.4.6 專屬性試驗 按處方配比，去除測定含有量藥材后的其他藥材，按退黃丸制法項下的工藝制成丸劑，再按供試品溶液的制備方法制得幾種陰性供試品溶液。精密吸取陰性供試品溶液10μL，測定，陰性供試品在相應(yīng)的保留時間無色譜峰干擾。

3.4.6 樣品測定 稱取成方制劑各3份 (20100309、20100310、20100311)，每份一定量，精密稱定，制成供試品溶液，利用外標(biāo)兩點法測定，計算綠原酸、梔子苷、葛根素、芍藥苷、大黃酸、秦皮甲素和秦皮乙素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測定結(jié)果見表4～6和圖5～9。

表4 綠原酸和梔子苷的測定結(jié)果Tab.4 Determ ination results of chlorogenic acid and geniposide

表5 秦皮甲素和秦皮乙素的測定結(jié)果Tab.5 Determ ination results of aesculin and aesculetin

表6 葛根素、芍藥苷和大黃酸的測定結(jié)果Tab.6 Determ ination results of puerarin，paeoniflorin and rhein

圖5 綠原酸和梔子苷混合對照品 (A)﹑退黃丸供試品 (B)﹑缺綿茵陳及梔子的陰性樣品 (C)HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of chlorogenic and geniposide reference substances(A)，Tuihuang Pills sam p le(B)and negative sam p le w ithout Artem isiae scopariae Herba and Gardeniae Fructus(C)

4 討論

4.1 退黃丸中大黃、葛根、赤芍、秦皮的定性鑒別，與各自的陰性對照液進(jìn)行了對照試驗，結(jié)果無干擾。按處方藥味比例，自配不含綿茵陳、梔子、葛根、赤芍、大黃和秦皮的陰性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)液相色譜中陰性供試溶液在與對照品相同保留時間處未顯色譜峰，表明陰性無干擾，說明本法準(zhǔn)確可靠，方法可行。

圖6 葛根素對照品 (A)、退黃丸供試品 (B)、缺葛根陰性樣品 (C)HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of puerarin reference substance(A)，Tuihuang Pills sample(B)and negative samp le w ithout Puerariae lobatae Radix(C)

圖7 芍藥苷對照品 (A)、退黃丸供試品 (B)、缺赤芍陰性樣品 (C)HPLC色譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of paeoniflorin reference substance(A)，Tuihuang Pills sample(B)and negative sample w ithout Paeoniae Radix rubra(C)

圖8 大黃酸對照品 (A)、退黃丸供試品 (B)、缺大黃陰性樣品 (C)HPLC色譜圖Fig.8 HPLC chrom atogram s of rhein reference substance(A)，Tuihuang Pills sample(B)and negative sam ple w ithout Rhei Radix et Rhizoma(C)

圖9 秦皮甲素和秦皮乙素混合對照品 (A)、退黃丸供試品 (B)、缺秦皮陰性樣品 (C)HPLC色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram s of aesculin and aesculetin reference substance(A)，Tuihuang Pills sam ple(B)and negative sam ple w ithout Fraxini Cortex(C)

4.2 在定性鑒別中，采用《中國藥典》方法三氯甲烷-甲醇-水 (7∶2.5∶0.25)鑒定葛根，葛根素分離效果不好，后改為三氯甲烷-甲醇-水 (7∶2∶0.5)作展開劑，取得滿意分離效果。

4.3 由于該制劑為醫(yī)院制劑，為更好地控制制劑質(zhì)量，對其中六味藥材綿茵陳、梔子、葛根、赤芍、大黃和秦皮做了HPLC的定量測定［8-13］，測得結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾味藥材中有效成分在藥材中的轉(zhuǎn)移率比較高，按本方制劑配比綠原酸、梔子苷、葛根素、芍藥苷、大黃酸、秦皮甲素和秦皮乙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)分別不低于1.2 mg/g、0.8 mg/g、0.3 mg/g、0.37 mg/g、0.11 mg/g、0.018 mg/g、0.15 mg/g，結(jié)果測定值符合《中國藥典》規(guī)定。

4.4 對于要同時測定的綠原酸及梔子苷，因其最大吸收波長［14-15］相差較大，利用全波長掃描最后確定在245 nm處兩者的響應(yīng)值相對較好，因此選擇245 nm波長作為檢測波長。

4.5 因該制劑中其他藥材成分中也含有大黃素甲醚，蘆薈大黃素等成分，對測定大黃中的其他4種成分有干擾，所以本試驗對大黃只測定了大黃酸。

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