紅霉素自乳化制劑處方研究

匡 扶 ，肖廷超 ，朱照靜 ，錢(qián) 妍

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，重慶 400010; 2.重慶醫(yī)科大學(xué)圖書(shū)館，重慶 400016; 3.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 400030)

自微乳化給藥系統(tǒng)(self－microemulsifying drug delivery system，SMEDDS)由藥物、油相、非離子型乳化劑和助乳化劑組成，在溫和攪拌下可自發(fā)形成O/W型微乳，其粒徑小于100 nm。SMEDDS可顯著提高水難溶性藥物的溶出度、口服吸收率和生物利用度[1]，是近年來(lái)藥劑學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。SMEDDS口服后在胃腸道內(nèi)迅速乳化，藥物可直接進(jìn)入小腸淋巴系統(tǒng)，后經(jīng)胸腺淋巴管轉(zhuǎn)運(yùn)，不進(jìn)入肝門(mén)靜脈[2]，因此可避免或減小藥物的肝首過(guò)效應(yīng)，提高藥物的生物利用度。SMEDDS一般分裝于軟膠囊中，制備工藝簡(jiǎn)單，性質(zhì)穩(wěn)定，劑量準(zhǔn)確且服用方便。紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，近年來(lái)，臨床報(bào)道其在各種感染和某些非感染性疾病治療中的應(yīng)用越來(lái)越多，如紅霉素可抑制一些抗癌藥從癌細(xì)胞內(nèi)的主動(dòng)外排，增強(qiáng)抗癌效果，并能逆轉(zhuǎn)某些惡性腫瘤對(duì)抗癌藥的耐藥性[3];能抑制肺間質(zhì)纖維化的形成[4];對(duì)于假單胞菌感染治療有特殊用途[5]。但由于紅霉素為水難溶性藥物，其口服制劑存在不耐酸、溶出難、口服吸收率為18%～45%、生物利用度差等問(wèn)題[6]，極大地限制了臨床應(yīng)用，將紅霉素制成SMEDDS有望解決上述問(wèn)題。

1 儀器與試藥

DF－101B型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);AB204－E型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);800型離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠);KQ2200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司儀);Zetasizer Nano納米粒度/zeta電位儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司);UV－3150型紫外分光光度計(jì)(日本島津株式會(huì)社);ZRS－8G型智能溶出儀(天津大學(xué)無(wú)線電廠)。橄欖油(OLIVE－OIL，盛隆天然藥油有限公司，批號(hào)為090535);十四酸異丙酯(isopropyl myristate，IPM，美國(guó)Fluka公司，批號(hào)分別為1216171，21106124);吐溫80(Tween 80，上海申宇醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)為090535);聚乙二醇400(PEG400)，天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)為20090120);聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyethylene castor oil，Cremophor EL，F(xiàn)luka，批 號(hào) 分 別 為1210306，44506130);聚乙二醇 －8－甘油辛酸 /葵酸酯(Labrasol，LAS，法國(guó)Gattefosse公司，Lot 33347);紅霉素原料藥(內(nèi)江山山制藥廠，批號(hào)為090301，純度為99.0%);紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為30307－200815純度不低于98%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅霉素溶解度測(cè)定

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取可形成微乳的油相(IPM，OLIVEOIL)、乳化劑(Tween 80，Cremophor EL)、助乳化劑(LAS，PEG400)進(jìn)行研究。取上述6種液體各2 mL，分別置10 mL試管中，逐步加入紅霉素原料藥約10 mg(以減量法計(jì)量)，每次超聲溶解20 min，溶解平衡室溫25℃靜置30 min，觀察溶解情況，直至飽和，根據(jù)《中國(guó)藥典》近似溶解度的概念，判斷出各種溶劑中藥物的溶解能力級(jí)別。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 紅霉素在不同溶劑中的溶解性(n=3)

根據(jù)表1結(jié)果，可選取溶解度大的IPM作為油相，LAS作為乳化劑。但紅霉素在Cremophor EL和Tween80中溶解度差別不大，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)超聲溶解過(guò)程中體系溫度上升時(shí)藥物均溶解，當(dāng)紅霉素質(zhì)量濃度大于20～30 g/L時(shí)室溫下靜置過(guò)夜后OLIVEOIL中的藥物析出。應(yīng)進(jìn)一步通過(guò)空白偽三元相圖進(jìn)行比較，確定EM－SMEDDS處方組分以及各組分的比例。

2.2 EM－SMEDDS處方構(gòu)成確定[7－9]

以 IPM為油相、LAS為助乳化劑，比較Tween 80與Cremophor EL為乳化劑時(shí)成乳情況，并確定各組分的最佳比例。通過(guò)滴定法繪制出油相－乳化劑/助乳化劑(混合乳化劑)－水體系的偽三元相圖，先將乳化劑與助乳化劑按照Km值為1∶1，2∶1和3∶1(W/W)的比例混合，在三元相圖中記為混合乳化劑(S－cos)，再與油相 IPM 按 Km 值 1 ∶9，2 ∶8，3 ∶7，4 ∶6，5 ∶5，6 ∶4，7 ∶3，8 ∶2，9∶1(W/W)比例混合，37℃水浴，逐滴加入蒸餾水，攪拌混勻，記錄系統(tǒng)狀態(tài)變化并用Origin 7.5軟件繪制偽三元相圖。結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2?？芍?，Cremophor EL成乳效果優(yōu)于 Tween80，當(dāng) Km相同時(shí)，Cremophor EL體系自微乳化區(qū)域更大，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Cremophor EL體系黏度更小、分散時(shí)間更短，有利于在胃腸道內(nèi)成乳。在油、混合乳化劑和水三者比例固定的情況下，當(dāng)Cremophor EL含量增加，Km值增大，雖自微乳化區(qū)域增大，但偽三元體系的黏度增加，易形成難以分散的稠厚凝膠;當(dāng)LAS含量增加，Km減小，體系黏度可有效降低，減少凝膠形成;同時(shí)提高LAS的比例還可提高載藥量，促進(jìn)藥物在胃腸體內(nèi)的吸收。因此，Cremophor EL成乳效果優(yōu)于Tween 80，選用Cremophor EL為EM－SMEDDS乳化劑，當(dāng)油相IPM與混合乳化劑比例在2∶(3～8)的范圍內(nèi)可形成微乳，其中混合乳化劑中Labrasol與Cremophor EL比例在11∶(21～33)的范圍即可。

圖1 以IPM為油相、Tween 80與Labrasol為混合乳化劑的偽三元相圖

圖2 以IPM為油相、Cremophor EL與Labrasol為混合乳化劑的偽三元相圖

2.3 制備方法對(duì)制劑粒徑的影響

2.3.1 處方組成和制備溫度

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇載藥量(X1)、體系中油相比例(X2)、混合乳化劑中Cremophor EL比例(X3)和制備溫度(X4)四者為自變量，自微乳的平均粒徑為因變量(Y)，方案設(shè)計(jì)成4因素3水平，為使結(jié)果更準(zhǔn)確，采用擬水平處理成9個(gè)水平[10－11]。用U9(95)均勻表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，見(jiàn)表2。

按表2設(shè)計(jì)，精密稱取相應(yīng)油相、乳化劑助、乳化劑和藥物，置西林瓶中，并在對(duì)應(yīng)的水浴溫度下攪拌混合20 min，冷卻至室溫備用。各組取0.05 mL EM－SMEDDS滴入50 mL、37℃恒溫的分散介質(zhì)(pH=6.8磷酸緩沖液)中，以轉(zhuǎn)速50 r/min攪拌20 min，取5 mL，用Zetasizer Nano納米粒度儀測(cè)定微乳的粒徑和粒徑分布范圍。測(cè)定條件為He－Ne激光，測(cè)量角度135°，溫度25℃，黏度0.933 cP，反射指數(shù) 1.43，波長(zhǎng) 632.8 nm。微乳粒徑測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表2。以各組平均粒徑為因變量，用SAS軟件包對(duì)各因素進(jìn)行多元非線性回歸二項(xiàng)式擬合模型，Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4X4+b5X21+b6X1X2+b7X22+b8X3X1+b9X3X2+b10X23+b11X4X1+b12X4X2+b13X4X3+b14X24。通過(guò)擬合方程的回歸系數(shù)r2對(duì)方程進(jìn)行準(zhǔn)確性檢測(cè)。處理結(jié)果可得以下模型，Y=90.390 833 － 0.283 067X1－0.983 000X2－0.451 667X3+0.032 917X4－ 0.000 457X21+0.009 173X2X1(r2=0.999 9，P＜0.000 5)。

表2 均勻設(shè)計(jì)因素與水平U9(95)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從模型可知4個(gè)因素對(duì)微乳平均粒徑的影響:當(dāng)制備溫度(X4)在30～70℃范圍內(nèi)升高，乳滴平均粒徑變大，故溫度為30℃時(shí)平均粒徑最小;混合乳化劑中Cremaonophor EL的比例(X3)在65% ～75%范圍內(nèi)增大，乳滴粒徑減小，故Cremophor EL占混合乳化劑的75%時(shí)粒徑最小;體系中油相所占比例(X2)和載藥量(X1)有交互影響，X3和X4與其他因素間沒(méi)有交互影響。為直觀地判斷X2和X1對(duì)粒徑的影響，可以固定X3為75%和X4為30℃后，通過(guò)ORING75軟件繪制曲面圖，見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)，當(dāng)載藥量(X1)為10%、體系中油相所占比例(X2)為20%時(shí)，乳滴的平均粒徑最小;固定載藥量10%、制備溫度為30℃時(shí)，體系中油相所占比例(X2):20%～40%范圍內(nèi)，混合乳化劑中Cremophor EL的比例(X3)在65% ～75%范圍內(nèi)的任意組合均可形成粒徑小于100 nm的微乳。

圖3 固定 X3及 X4時(shí)，X1及 X2對(duì)平均粒徑作效應(yīng)曲面圖

綜合考慮到油相IPM是含17個(gè)碳的長(zhǎng)鏈脂肪酸，在處方中適當(dāng)增加比例可促進(jìn)藥物的淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，減少紅霉素的首過(guò)效應(yīng)，提高生物利用的目的。從偽三元相圖的繪制過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，乳化劑Cremophor EL含量增大時(shí)體系黏度增大、分散時(shí)間延長(zhǎng)，助乳化劑LAS比例增加可以促進(jìn)微乳迅速分散并促進(jìn)藥物的吸收。因此確定，EM－SMEDDS處方為體系中油相與混合乳化劑比例為3:7，混合乳化劑中LAS與Cremophor EL質(zhì)量比為7∶13，載藥量為10%，紅霉素自微乳化制劑的乳化后粒徑較小，粒徑分布均勻且分散迅速。

2.3.2 加料順序

水浴30℃時(shí)，以IPM為油相、油相與混合乳化劑質(zhì)量比為3∶7、混合乳化劑中 LAS與Cremophor E質(zhì)量比為7∶13、載藥量為10%，分別按以下方式加料:油相、乳化劑和助乳化混合均勻后再加入藥物(Ⅰ);藥物溶解于油相后，再與乳化劑和助乳化混合均勻(Ⅱ);藥物溶解于乳化劑后，再加入油相和助乳化混合均勻(Ⅲ);藥物溶解于助乳化劑后，再加入乳化劑和油相混合均勻(Ⅳ);4種物質(zhì)全部加入后再混合(Ⅴ);油相、乳化劑混合均勻，為空白SMEDDS(Ⅵ)。取上述配制的 EM－SMEDDS 0.5 mL滴入 50 mL、恒溫37℃的水相中，以轉(zhuǎn)速 50 r/min攪拌 20 min，取5 mL，用Zetasizer Nano納米粒度儀測(cè)定微乳的粒徑和粒徑分布范圍。測(cè)量條件見(jiàn) 2.3.1 項(xiàng)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加料順序?qū)ξ⑷榱?、粒徑分布的影?/p>

可見(jiàn)，加料順序?qū)θ榈纹骄胶土椒植加杏绊?，第Ⅰ和第Ⅳ種方法的微乳粒徑最小，粒徑分布也相對(duì)較窄，原因可能是單獨(dú)的每一種組份對(duì)紅霉素的溶解能力均有限，這兩種方法的混合體系能有效提高對(duì)紅霉素的溶解能力;藥物的加入使其形成的微乳粒徑變小。第Ⅰ和第Ⅳ種方法都可制得粒徑小且粒徑分布也相對(duì)較窄的EM－SMEDDS，但考慮到后期試驗(yàn)中需要空白基質(zhì)與對(duì)照，故本試驗(yàn)中選取第Ⅰ種方法。

2.3.3 自乳化效率

確定EM－SMEDDS處方構(gòu)成，即以IPM為油相，油相與混合乳化劑質(zhì)量比為3∶7，混合乳化劑中LAS與Cremophor E質(zhì)量比為7:13，載藥量為10%。制備方法是30℃水浴，先將油相、乳化劑和助乳化劑混合均勻，然后加入原料藥，溶解混勻即得。用此方法制備3組EM－SMEDDS，采用溶出度測(cè)定方法中的小杯法，加入蒸餾水250 mL、37℃恒溫的分散介質(zhì)(pH=6.8磷酸鹽緩沖液)，精密量取 EM －SMEDDS 0.5 mL，注入杯底部，37 ℃恒溫，以50 r/min攪拌分散，攪拌開(kāi)始時(shí)計(jì)時(shí)，測(cè)定處方的分散時(shí)間，并測(cè)定所成微乳的平均粒徑和粒徑分布情況[12]。結(jié)果見(jiàn)表4。可見(jiàn)，該處方組成的EM－SMEDDS所成微乳平均粒徑小于50 nm，粒徑分布窄，且成乳迅速。

表4 EM－SMEDDS微乳的平均粒徑和分布

2.4 EM－SMEDDS處方構(gòu)成確定

以IPM為油相，油相與混合乳化劑質(zhì)量比為3∶7，混合乳化劑中LAS與Cremophor E質(zhì)量比為7∶13，載藥量為10%，該紅霉素自微乳化制劑的乳化后粒徑較小，粒徑分布均勻且分散迅速。EM－SMEDDS的制備方法先將油相、乳化劑和助乳化劑混合均勻，然后加入原料藥，溶解混勻即得。

3 討論

3.1 處方組成選擇

油相:IPM是天然植物油提取物，對(duì)人體無(wú)影響，且可與多種乳化劑混合形成微乳，是制備微乳和自微乳的良好油相，而在預(yù)試驗(yàn)中以橄欖油為油相卻難以形成微乳;微乳區(qū)面積的大小與油相分子量有關(guān)，分子量大的油相難以形成微乳，小分子油相的作用類(lèi)似于助化劑，易嵌入到乳化劑中，與之形成界面膜，乳化劑對(duì)小分子油相的增溶量大于大分子油相。乳化劑:制備O/W微乳一般采用HLB值為10～15的非離子型乳化劑，比離子型乳化劑毒性低，但也會(huì)引起胃腸道壁滲透性的可逆性轉(zhuǎn)變[11];本試驗(yàn)選取口服安全的乳化劑Cremophor EL，比Tween 80所形成微乳區(qū)域較大，不易形成凝膠，容易分散，長(zhǎng)期放置較穩(wěn)定。助乳化劑:助乳化劑的分子嵌入乳化劑分子中共同形成膠束的界面膜，起降低界面張力、增加界面膜的流動(dòng)性、調(diào)節(jié)HLB值的作用，由此形成的微乳粒徑較小，口服常用助乳化劑有乙醇、異丙醇、甘油、聚乙二醇、Transcutol(乙二醇單乙基醚)等，因乙醇等揮發(fā)性助乳化劑能遷移入明膠膠囊殼中，有可能導(dǎo)致藥物析出，在預(yù)試驗(yàn)中選擇LAS和PEG400作為輔助表面活性劑來(lái)考察對(duì)微乳形成的影響，結(jié)果PEG400作助乳化劑雖能形成微乳，但容易形成凝膠而難以分散，而LAS能明顯降低體系的黏度而容易分散。

3.2 勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

因素水平選擇時(shí)，載藥量主要依據(jù)2.1項(xiàng)下的紅霉素溶解度試驗(yàn)，體系中油相比例、混合乳化劑中組分比例兩個(gè)因素主要是依據(jù)2.2項(xiàng)下的空白偽三元相圖。而預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，制備溫度對(duì)SMEDDS成乳的粒徑有影響，溫度越低，所成微乳的粒徑越小，當(dāng)溫度高于70度時(shí)成乳粒徑大于100 nm，考察無(wú)意義?？紤]到實(shí)際操作過(guò)程一般為常溫(25～40)℃，但因混合過(guò)程以及攪拌過(guò)程都能產(chǎn)生熱量故考察溫度定為30～70℃。勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)的考察指標(biāo)為粒徑大小和粒徑分布寬度，沒(méi)有將劑型分散時(shí)間作為考察指標(biāo)。因?yàn)樵陬A(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Km在1∶1～1∶4時(shí)之間，油相與混合乳化劑比例為1∶4～1∶1均可在10 min內(nèi)迅速分散形成微乳符合藥典要求，再以劑型分散時(shí)間作為考察指標(biāo)沒(méi)有實(shí)際意義。

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