燈盞花素分散片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究＊

黃曉燕，丁 野，鄭金鳳，李文莉

(湖南省食品藥品檢驗研究院，湖南 長沙 410001)

燈盞花素是從菊科植物短亭飛蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.－Mazz.中以野黃芩苷為主的提取物。燈盞花素分散片是由燈盞花素原料制成的中藥固體制劑，具有活血化瘀，通絡(luò)止痛的功效，臨床用于中風(fēng)后遺癥、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛[1－2]。燈盞花素分散片中可能含有的肝毒性成分焦袂康酸[3]，會對長期服用的患者肝臟有較大損傷，因此建立焦袂康酸的限量檢查方法對于保證本品臨床用藥的安全性具有重要意義。為更好地控制燈盞花素分散片的質(zhì)量，筆者采用薄層色譜法建立了野黃芩苷的薄層色譜鑒別法，并采用高效液相色譜法對野黃芩苷進(jìn)行了含量測定。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(包括自動進(jìn)樣器，柱溫箱，Chemstation工作站，Agilent公司);瑞士CAMAG Reprostar3型薄層攝像系統(tǒng);AE240型電子天平(德國梅特勒公司);CG－300型超聲清洗儀(功率300 W，頻率25 kHz，張家港市港威超聲電子有限公司);聚酰胺薄膜(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠)。野黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110842－200605);焦袂康酸對照品(天津市奎青商貿(mào)有限公司，批號為20100522，純度為98%);水為重蒸水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。燈盞花素分散片(批號 090701，090702，090703，090704，090801，100301，100401，購自國內(nèi)某制藥公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 野黃芩苷薄層色譜鑒別

取本品2片，研細(xì)，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取野黃芩苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例稱取輔料適量，同法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以冰醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。供試品溶液色譜中，在與野黃芩苷對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照溶液對測定無干擾(見圖1)。

圖1 野黃芩苷薄層色譜圖

2.2 焦袂康酸限量檢查

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent TC C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:A為甲醇，B為0.1%磷酸水溶液，洗脫梯度(0～25 min，100%B;25～27 min，0%→30%A;27～35 min，30%A);流速:0.8 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測波長:270 nm;進(jìn)樣體積:5 μL。

2.2.2 溶液制備

取本品粉末0.9 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入甲醇20 mL，超聲處理(功率300 W，頻率25 kHz)30 min，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按燈盞花素分散片處方比例及工藝制成成不含燈盞花素的陰性樣品，依法制備陰性對照品溶液。精密稱取焦袂康酸對照品10.60 mg，置10 mL容量瓶中，加適量甲醇使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。將此對照品溶液進(jìn)一步稀釋得質(zhì)量濃度為84.8 μg/mL 的對照品溶液Ⅰ，質(zhì)量濃度為 10.176 μg/mL 的對照品溶液Ⅱ以及質(zhì)量濃度為1.017 6 μg/mL的對照品溶液Ⅲ。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗:取焦袂康酸對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液，在上述色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見圖2?？梢姡柜强邓岱逍瘟己?，且陰性對照溶液色譜中，在焦袂康酸對照品相應(yīng)的保留時間附近無干擾峰。

圖2 焦袂康酸高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密吸取 2.2.2 項下對照品溶液Ⅰ5，10 μL、對照品溶液Ⅱ1，2，5，10 μL注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=10 000 000X－145 577，r=0.999 0(n=6)。結(jié)果表明，焦袂康酸對照品進(jìn)樣量在0.010 2～0.848 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗:精密吸取同一對照品溶液，依法重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的RSD為1.20%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一供試溶液，分別于配制后的0，4，8，12，16，24 h 時依法測定。結(jié)果的RSD為 1.09%(n=6)，表明供試品溶液在配制后24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取同一批(批號為090701)樣品，分別按2.2.2項下方法制備5份供試品溶液，依法測定。結(jié)果均未檢出焦袂康酸。

檢測限和定量限確定:以信噪比約為3∶1確定，檢測限為2.0 ng。以信噪比約為10∶1時連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積的RSD為3.57%，定量限為 5.0 ng。

加樣回收試驗:取已測定含量的同一批(批號為090701，未檢出焦袂康酸)樣品內(nèi)容物6份，每份約0.45 g，精密稱定，分別精密加入對照品適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，依法測定并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 焦袂康酸加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.2.4 樣品檢測

取不同批號的7批樣品，依法測定，結(jié)果所有批號的樣品均未檢出焦袂康酸。

2.3 野黃芩苷含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Agilent TC C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇－四氫呋喃－0.1%磷酸溶液(14∶14∶72);流速:0.8 mL/min;檢測波長:335 nm;柱溫:35℃;進(jìn)樣體積:10 μL。理論塔板數(shù)按野黃芩苷峰計算，應(yīng)不低于3 000。此條件下野黃芩苷峰峰形對稱、尖銳，與相鄰峰達(dá)到基線分離。色譜圖見圖3。

圖3 野黃芩苷高效液相色譜圖

2.3.2 溶液制備

取質(zhì)量差異項下的本品，研細(xì)，取約0.08 g，精密稱定，置100mL容量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理(功率300W，頻率25kHz)15 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按燈盞花素分散片處方比例及工藝制成成不含燈盞花素的陰性樣品，依法制備陰性對照品溶液。精密稱取野黃芩苷對照品10.60 mg，置50 mL量瓶中，加入甲醇適量，振搖使溶解，加甲醇稀釋至刻度，即得對照品溶液。將此對照品溶液進(jìn)一步稀釋得濃度為53 μg/mL的對照品溶液Ⅰ。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗:取野黃芩苷對照品、供試品溶液和陰性對照溶液，在上述色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果陰性對照品溶液色譜中，在野黃芩苷對照品相應(yīng)的保留時間附近無干擾峰(圖3)。

線性關(guān)系考察:精密吸取對照品溶液(0.212 g/L)10 μL及對照品溶液Ⅰ(0.053g/L)1，2，5，10，15μL，注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=3 965.3X+7.790 9，r=0.999 8(n=6)。結(jié)果表明，野黃芩苷對照品進(jìn)樣量在0.053～2.12μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗:精密吸取同一對照品溶液，依法重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的RSD為0.12%(n=6)，表明精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一供試品溶液(批號為090701)，分別于配制后的 0，4，8，12，16，24 h 時依法測定。結(jié)果的RSD為0.26%(n=6)，表明供試品溶液在配制后24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取同一批(批號為090701)樣品，分別按2.3.2項下方法制備5份供試品溶液，依法測定。結(jié)果樣品中野黃芩苷的平均含量為每片 16.73 mg，RSD為 1.59%(n=5)。

檢測限和定量限確定:以信噪比約為3∶1確定，檢測限為5.3 ng。以信噪比約為 10:1時連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積RSD為1.46% ，定量限為 15.9 ng。

加樣回收試驗:取已測定含量的同一批(批號為090701)樣品內(nèi)容物6份，每份約0.04 g，精密稱定，分別精密加入對照品適量，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，依法測定并計算野黃芩苷的回收率。結(jié)果見表2。

表2 野黃芩苷加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.3.4 樣品含量測定

取不同批號的7批樣品，依法測定。結(jié)果批號分別為090701，090702，090703，090704，090801，100301，100401 的樣品中 每 片 分 別 含 野 黃 芩 苷 16.99，16.54，16.09，16.36，15.54，15.67，16.86 mg。

3 討論

采用薄層色譜法對燈盞花素分散片中的野黃芩苷進(jìn)行了鑒別，結(jié)果薄層色譜斑點(diǎn)清晰、方法專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，且陰性無干擾。在12，20，28℃ 3種溫度和35%，57%，78%3種相對濕度條件下進(jìn)行溫度及濕度影響因素考察，結(jié)果顯示溫度和相對濕度的變化對薄層色譜鑒別無明顯影響。

焦袂康酸的檢測方法文獻(xiàn)報道較少，2010年版《中國藥典(一部)》中僅有“燈盞生脈膠囊”一個品種的焦袂康酸檢查方法。參照該化學(xué)反應(yīng)法試驗，發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)專屬性不強(qiáng)，故考慮采用高效液相色譜法進(jìn)行限量檢查。結(jié)果表明，采用高效液相色譜法進(jìn)行限度檢查準(zhǔn)確、靈敏度高，提高了檢測的可信度。

野黃芩苷含量測定時，曾考察了甲醇－0.1%磷酸系統(tǒng)、甲醇－0.1mol/L 醋酸銨溶液系統(tǒng)、甲醇 － 四氫呋喃 －0.1%磷酸系統(tǒng)[1，4－6]。結(jié)果甲醇－四氫呋喃－0.1%磷酸系統(tǒng)所得野黃芩苷色譜峰的對稱性相對而言最理想，故選擇甲醇－四氫呋喃－0.1%磷酸系統(tǒng)為流動相。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:378，707.

[2]WS3－B－2516－97.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(第十三冊)[S].

[3]Kazuyuki Kitamura，Hitoshi O Iwasaki，Akira Yasoshima.Pathology of Chemically Induced Chronic Active Hepatitis In Mice[J].Experimental And Molecular Pathology，1992，57(2):153 －166.

[4]Bhathal PS，Ho SL，Hegarty MP，et al.Chronic active hepatitis in mice inducedby3 －h(huán)ydroxy －4 － pyrone[J].Experientia，1984，40(8):894 －896.

[5]鄭金鳳，李文莉，馮 芳，等.HPLC法測定燈盞花素注射液中野黃芩苷含量及有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志，2011，31(1):34－38.

[6]嚴(yán)亞鋒，馬文龍.HPLC法測定心腦聯(lián)通分散片中野黃芩苷的含量[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，34(4):88－89.