腦源性神經營養(yǎng)因子經Akt/eNOS通路在大鼠蛛網膜下腔出血后早期腦損傷中的表達☆

黃偉朱繼熊海兵徐睿鄭鋒

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后早期腦損傷(early brain injury,EBI)的轉歸對患者預后有明顯影響，其中全腦缺血是發(fā)生EBI的重要組成部分。腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)是一種腦保護因子，有利于腦損傷的修復，對神經元起保護作用[1]，同時還是一種新的促血管新生因子[2]，其通過激活PI3K/Akte/eNOs/eNO信號通路以促進內皮細胞增殖血管[3]，而此通路同時也是VEGF調控血管新生的重要信號轉導通路[4,5]。目前有研究發(fā)現，BDNF在腦缺血的治療中發(fā)揮重要作用[6]。本實驗旨在檢測BDNF在SAH后早期腦損傷中表達，并進一步檢測eNOs與VEGF的表達，從而初步探討B(tài)DNF可能在SAH后EBI中發(fā)揮作用的機制及通路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康雄性SD大鼠72只，體質量250～300g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。大鼠隨機分為假手術組(sham組)、SAH后12h、24h、48h組，每組18只。每組6只用于聚合酶鏈式反應，6只用于蛋白質印跡分析，6只用于測量大鼠腦含水量。前期實驗已證實sham組各時間點中BDNF、VEGF和eNOs的表達無統計學差異，故均于術后48h處死。Anti-BDNF、Anti-eNOs和VEGF Receptor均購于美國Cell Signaling Technology公司，Trizol試劑盒、RT-PCR檢測試劑盒購自Takara公司。

1.2 SAH模型的制備 采用改良的視交叉前池注血法建立大鼠SAH模型[6]。將動物固定于腦立體定位儀上；沿顱頂正中矢狀線切開皮膚，鈍性分類肌肉及骨膜，于冠狀縫前5.0mm，中線旁開3.0 mm處，以電動牙科鉆鉆孔。顯露額極，用4號針頭小心將腦膜挑破，見腦脊液流出時，將PE 10導管尖端從額極緊貼前顱窩底蛛網膜下腔向雙耳連線中點送入，進入深度為10 mm。連接注射器回抽，見清亮腦脊液，證實未造成腦組織損傷。從股動脈插管抽取自體動脈血250μL，經PE10導管在12 s內緩慢注入蛛網膜下腔。拔出導管，以骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮，并維持頭低位30 min。對照組動物按上述方法操作，但蛛網膜下腔置管后注入等量生理鹽水。

1.3 VEGF、BDNF和eNOs的mRNA的檢測 按照Trizol試劑盒說明提取海馬組織總RNA。紫外分光光度法測定RNA的含量，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。采用兩部法RT-PCR試劑盒配置反應體系。VEGF、BDNF和eNOs引物均由Takara公司設計并合成。BNDF的上游引物：AGGAATACAAAAATTACCTGGATGC，下游引物：ACGATTGGGTAGTTCGGCATT，擴增片段為309bp。VEGF的上游引物：GCAATGATGAAGCCCTGGAGT，下游引物：TTCTCCGCTCTGAACAAGGCT，擴增片段為264bp。eNOs的上游引物：GGCGTCTTCAGAGCTGTACAC，下 游 引 物 ：CTAAGGCGGTTGGTCACTTCATA，擴增片段為320bp。內參的上游引物：CCTGAAGTACCCCATTGAACAC，下游引物：CTCATTGCCGATAGTGATGACC，擴增片段為562bp。RT-PCR產物在5%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下拍照，采用Quantity-One圖像處理系統分析比較電泳條帶相對光密度值。

1.4 大鼠海馬組織VEGF、BDNF和eNOs的蛋白分析 取大鼠海馬組織100 mg，裂解、離心、定量。提取含30μg蛋白的樣品進行SDS-PACE凝膠電泳。然后轉印至硝酸纖維膜，浸入封閉液中(37℃,2 h)。加入一抗并4℃冰箱孵育過夜，以即用型緩沖液(TBST)洗膜3次，每次10～15 min；加入辣根過氧化物酶標記驢抗羊IgG(二抗)，搖床上37℃孵育90 min，以TBST洗膜3次，加入新鮮配制的底物反應液，輕搖至顯色后，去離子水漂洗終止顯色。成像后由Quantity-One軟件系統計算VEGF、BDNF及eNOs與β-actin的光密度值，二者比值作為該樣品VEGF、BDNF和eNOs蛋白的表達量。

1.5 大鼠腦含水量(brain water content,BWC)的測定 BWC的測定采用干濕重法[7]。不同時相點大鼠處死后迅速斷頭取腦，去除皮質表面的軟腦膜、小腦、腦干，取雙側大腦皮層及海馬，取小腦組織作為正常對照，并稱取濕重(Wet Weight)，然后放入110℃電熱干烘箱中烘干至恒重，再稱干重(Dry Weight)(兩次Dry Weight之差＜0.001 mg)。根據如下公式計算：BWC=(濕重一干重)/濕重×100%。

1.6 統計學分析 運用SPSS 17.0處理，多組間均數的比較采用單因素方差分析，用LSD-t檢驗比較兩兩之間的差異，變量之間采用Pearson相關分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠海馬組織VEGF、BDNF和eNOs mRNA表達變化 SAH組VEGF、BDNF和eNOsmRNA的濃度在各時間點呈現動態(tài)變化，SAH后12h大鼠海馬組織VEGF、BDNF和eNOsmRNA較Sham組開始明顯增高(與Sham組相比，P＜0.05)；SAH后24h海馬組織VEGF、BDNF和eNOs表達達到高峰(與Sham組相比，P＜0.05)；SAH后48h大鼠海馬組織VEGF、BDNF和eNOsmRNA活性開始下降，但仍高于Sham組水平(P＜0.05)，見圖1、表1。

2.2 大鼠海馬組織VEGF、BDNF和eNOs蛋白表達水平變化 SAH組VEGF、BDNF和eNOs的蛋白濃度在各時間點呈現動態(tài)變化，SAH后12h大鼠海馬組織VEGF、BDNF和eNOs蛋白表達較Sham組開始明顯增高(P=0.031)；SAH后24h海馬組織VEGF、BDNF和eNOs表達達到高峰(與Sham組相比，P=0.019)；SAH 后 48h大鼠海馬組織VEGF、BDNF和eNOs蛋白表達活性開始下降，但仍高于Sham組水平(P=0.027)，見圖2、表2。

圖1 RT-PCR顯示Sham組及SAH后各個時間點VEGF、BDNF和eNOsmRNA的表達。

表1 大鼠海馬組織VEGF、BDNF和eNOs mRNA的表達

2.3 SAH后大鼠腦損傷的變化 SAH后12h大鼠腦含水量(BWC)較Sham組開始明顯增高(P＜0.05)；SAH后24h腦含水量達到高峰(與Sham組相比，P＜0.05)；SAH后48h大鼠腦含水量開始下降，但仍高于Sham組水平(P＜0.05)，見表2。

2.4 BDNF表達量與大鼠腦含水量的相關性 SAH后大鼠海馬組織BDNF蛋白表達量與大鼠腦含水量兩者間呈正相關(r=0.885，P＜0.01)。

圖2 Western Blot顯示Sham組及SAH后各個時間點VEGF、BDNF和eNOs蛋白表達及。

2.5 BDNF、VEGF和eNOs三者蛋白表達量間的相關性 運用Pearson相關假設檢驗表明，在SAH發(fā)生后，BDNF和VEGF兩者蛋白表達變化呈明顯正相關(rBV=0.904，P＜0.01)。eNOs與 BDNF及VEGF之間蛋白表達變化呈明顯正相關(rNV=0.953，P＜0.01；rBN=0.897，P＜0.01)。

3 討論

自發(fā)性SAH是一種破壞性疾病，具有很高死亡率，約40%的患者初次出血后在48h內死亡[8]，其主要原因是顱內動脈瘤破裂出血(約80%)[9]?，F在認為，早期腦損傷(EBI)[10]相比于腦血管痙攣(cerebral vasospasm,CVS)在患者預后中具有更重要的地位，它指的是從初次出血那刻起到遲發(fā)型血管痙攣發(fā)生前腦組織內發(fā)生的一系列變化[11]。在EBI中有許多機制的改變，包括顱內壓(intracranial pressure,ICP)升高、腦血流量(cerebral blood flow,CBF)減少、腦灌注壓(cerebral perfusion pressure,CPP)降低、血管收縮、血管腔內阻塞等等。這些都會造成全腦缺血，從而引起細胞凋亡或壞死，造成血腦屏障(blood brain barrier,BBB)破壞、腦水腫，最終導致EBI[12]。因此，對于腦缺血的治療在SAH患者預后中具有至關重要作用。海馬區(qū)神經元對缺血區(qū)有選擇性敏感，所以海馬成為腦損傷研究的一個典型腦區(qū)[13]。

BDNF是一種神經營養(yǎng)因子，其能對抗高濃度氨基酸的神經毒性，下調N—甲基一D一天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體功能，誘導鈣結合蛋白的表達而穩(wěn)定細胞內Ca2+濃度，減少自由基生成，抑制細胞凋亡[14]，減輕腦缺血缺氧性損害，促進損傷神經元再生等。新近研究發(fā)現BDNF還是一種新的促血管新生因子[2]，能通過激活PI3K/Akt、MEK1/ERK信號通路以促進內皮細胞增殖及維持血管穩(wěn)定性[3]。本實驗發(fā)現，發(fā)生SAH后早期腦損傷12h后，BDNF表達量開始升高，在24h時達到高峰，并于48h后開始下降，但仍明顯高于對照組，其表達變化與腦含水量變化呈正相關，提示BDNF在SAH后早期腦損傷中很可能起有重要作用。同時eNOs表達量與BDNF為正相關，說明BDNF在腦損傷中是通過Akt/eNOs通路發(fā)揮作用。據Yao RG等[15]研究發(fā)現，在發(fā)生腦缺血時，BDNF很可能是通過PI3K/Akt/eNOs通路以抑制腦細胞凋亡，因此很可能BDNF在SAH后發(fā)生全腦缺血時也同樣經此通路發(fā)揮修復作用，但還需在后續(xù)實驗中用阻斷劑Ly294002阻斷BDNF介導的Akt磷酸化過程，測量腦損傷變化以證明。

表2 大鼠海馬組織VEGF、BDNF和eNOs的蛋白表達和腦含水量

VEGF是一種促血管內皮細胞生長因子[16]，其在腦血管病中的作用已得到充分肯定，在SAH后大腦修復過程中起重要作用。有報道指出[17]，PI3K/Akt/eNOS途徑活化后，釋放的eNO可上調VEGF mRNA的表達。本實驗中，發(fā)現VEGF的mRNA和蛋白表達量同樣在SAH后明顯增高，BDNF與VEGF表達量成正相關，提示BDNF與VEGF兩者在SAH后早期腦損傷中有密切關系。eNOs與VEGF表達正相關，提示當發(fā)生SAH后早期腦損傷時，BDNF很有可能即是通過活化的PI3K/Akt/eNOS/eNO途徑，增加VEGF合成，促進血管生成。

本實驗還發(fā)現，在早期腦損傷后，實驗組BDNF表達量仍維持在較高水平，因此BDNF除了在發(fā)生SAH后早期發(fā)揮作用外，在隨后遲發(fā)性腦血管痙攣過程中可能仍有重要作用，這還需要進一步研究。

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