顆粒型和整體化色譜柱分析絡(luò)石藤指紋圖譜

熊野娟 ，周淑琴 ，范松華 ，姚 虹

(1.上海醫(yī)藥高等專科學(xué)校，上海 201318； 2.上海市醫(yī)藥學(xué)校，上海 200135)

絡(luò)石藤為夾竹桃科植物絡(luò)石 Trachelospermum jasminoides(Lindl.)Lem.的干燥帶葉藤莖。2010年之前的《中國藥典》收載于附錄中，2010年版《中國藥典(一部)》正式收載于正文中[1]，并制定了以絡(luò)石苷的含量測定項(xiàng)，但未收載其指紋圖譜／特征圖譜的質(zhì)控項(xiàng)目。文獻(xiàn)[2]報(bào)道了絡(luò)石藤的指紋圖譜分析，并以去甲絡(luò)石苷等多個(gè)化學(xué)對照品為參比成分，對14批藥材進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的藥材可能存在差異。高效液相色譜法生成的指紋圖譜具有分辨率高、信息量大、方法穩(wěn)定可靠的特點(diǎn)，在中藥材質(zhì)控中占有重要的地位。但是，一份樣品的分析時(shí)間通常需要至少60 min，不利于大批量樣品的快速鑒定。筆者在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，在中藥材指紋圖譜分析中使用整體化色譜柱可以縮短分析時(shí)間。在本項(xiàng)研究中，建立不同色譜柱的分析方法，并進(jìn)行了對比。

1 儀器與試藥

Mettler Toledo AB265－S型電子天平；KQ－700VDV型超聲波清洗機(jī)；TGL－16G型高速離心機(jī)；Waters 2695型液相色譜儀，包括Alliance 2695分離單元、2998二極管陣列檢測器和EmpowerⅡ工作站；Agilent1200型高效液相色譜儀，包括G1311A四元梯度泵、G1322A脫氣機(jī)、G1329A自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1314B紫外檢測器和 Chemstation B.03工作站。常規(guī)色譜柱為Zorbax Eclipse plus C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm，Agilent 959990－902)，整體化色譜柱為 Chromolith Performance RP－18e柱(100 mm ×4.6 mm，Merck 1.02129)。藥材和飲片均為從市場采購，并經(jīng)上海市食品藥品檢驗(yàn)所鑒定為夾竹桃科植物絡(luò)石 Trachelospermum jasminoides(Lindl.)Lem.的干燥帶葉藤莖，詳細(xì)情況見表1。絡(luò)石苷對照品由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中藥研究所劉安博士惠贈，高效液相色譜歸一化純度大于99%。

表1 樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件選擇

研究發(fā)現(xiàn)，盡管采用乙腈為有機(jī)相可以得到尖銳的峰形，但洗脫色譜峰的個(gè)數(shù)比采用甲醇時(shí)少，意味著某些成分未能分離；此外，在水相中加入磷酸或醋酸后，對洗脫峰的數(shù)量、峰形和峰的分離度沒有明顯的影響，因此選擇甲醇－水梯度洗脫為流動相。

系統(tǒng)A采用常規(guī)的顆粒型填料色譜柱(Eclipse plusC18柱)，并經(jīng)優(yōu)化設(shè)定如下的梯度系統(tǒng)程序：0～60min，甲醇 17% ～55%，60～80 min，甲醇 55% ～90%。系統(tǒng)B采用整體化色譜柱(Chromolith RP－18e柱)，設(shè)定梯度系統(tǒng)程序如下：0～1 min，甲醇 5%，1～3 min，甲醇 5% ～20%，3～18 min，甲醇 20% ～35% ，18～26 min，甲醇35%～90%。

采用二極管陣列檢測器記錄絡(luò)石苷對照品主峰的紫外吸收光譜，在220 nm和280 nm處有最大吸收。對比220，254和280 nm下采集的同一藥材樣品色譜圖，見圖1，220 nm和280 nm下色譜峰的強(qiáng)度最高，但220 nm下基線的飄移也更顯著，因此選擇280 nm為檢測波長。

為了保證系統(tǒng)的重現(xiàn)性，均設(shè)定30℃的柱溫。

圖1 同一樣品溶液不同檢測波長下的色譜圖(系統(tǒng)A，自上至下分別為254 nm、220 nm和280 nm)

2.2 溶液制備

參照藥典，將藥材和飲品適當(dāng)粉碎，精密稱取5 g，置三角瓶中，精密加入甲醇25m L，精密稱定質(zhì)量；超聲(250W)30min；具塞靜置過夜后再次超聲(250W)30min；冷卻至室溫后再次精密稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的甲醇，搖勻。16000r／min離心15min，取上清液1 mL，加水0.5 m L，混勻，作為樣品溶液。精密稱取絡(luò)石苷對照品0.500 g，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。

2.3 不同系統(tǒng)建立的指紋圖譜

系統(tǒng)A在60min內(nèi)完成指紋圖譜的分析(除溶劑峰外)，在樣品中共標(biāo)記了15個(gè)共有峰，其中，7號峰(保留時(shí)間約為35.2min)為參比物質(zhì)絡(luò)石苷峰。系統(tǒng)A的色譜圖見圖2，圖中用數(shù)字標(biāo)注出了共有峰。

圖2 系統(tǒng)A中空白溶劑(上)、絡(luò)石苷對照品溶液(中)和典型樣品(下)的色譜圖

采用整體化色譜柱的系統(tǒng)B在25 min內(nèi)完成指紋圖譜的分析(包括分析后的再次平衡)，在樣品中共標(biāo)記了14個(gè)共有峰，其中，6號峰(保留時(shí)間約為13.7 min)為參比物質(zhì)絡(luò)石苷峰。系統(tǒng)B的色譜圖見圖3，圖中用數(shù)字標(biāo)注出了共有峰。

圖3 系統(tǒng)B中空白溶劑(上)、絡(luò)石苷對照品溶液(中)和典型樣品(下)的色譜圖

在兩個(gè)系統(tǒng)下，空白溶劑對樣品的測定均無干擾，樣品中參比峰(絡(luò)石苷)的確認(rèn)分別經(jīng)過了對照品和紫外吸收光譜的驗(yàn)證。

從兩個(gè)系統(tǒng)所得的色譜圖可以看出，顆粒型填料色譜柱具有更好的分離度，而整體化色譜柱則具有較快的分析時(shí)間。整體化色譜柱對參比峰及其后洗脫的兩個(gè)小峰分離欠佳，除此之外，兩個(gè)系統(tǒng)得到的色譜圖類型相近。各共有峰的相對保留時(shí)間也非常接近。

2.4 精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性考察

取0號樣品制備一份樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄共有峰與參比峰的保留時(shí)間和各共有峰的相對峰面積峰面積。兩個(gè)系統(tǒng)中，保留時(shí)間的差異均在2.0%以內(nèi)；共有峰相對峰面積的差異均小于3.0%。取0號樣品制備6份樣品溶液，分別進(jìn)樣，記錄共有峰與參比峰的保留時(shí)間和各共有峰的相對峰面積峰面積。兩個(gè)系統(tǒng)中，保留時(shí)間的差異均在2.0%以內(nèi)；共有峰相對峰面積的差異均小于3.0%。取0號樣品溶液，室溫下放置36 h，分別在第6，12，24，36 h在系統(tǒng) A中進(jìn)樣測定，所得圖譜中，各色譜峰的保留時(shí)間、相對峰面積均無明顯差異，顯示樣品溶液可以穩(wěn)定儲存36 h。

2.6 樣品的分析結(jié)果

兩個(gè)系統(tǒng)下，1號樣品均只有1個(gè)較明顯的色譜峰，峰面積不到其他樣品總峰面積的10%，推測為經(jīng)過提取后的偽品。按照中國藥典絡(luò)石藤項(xiàng)下進(jìn)行的鑒別實(shí)驗(yàn)也呈陰性反應(yīng)。其余9份樣品在兩個(gè)系統(tǒng)中的色譜圖分別見圖4和圖5。兩個(gè)系統(tǒng)下共有峰相對保留時(shí)間的數(shù)據(jù)分別見表1和表2、相對峰面積的數(shù)據(jù)分別見表3和表4(1號樣品因?qū)賯纹?，未提供圖譜和數(shù)據(jù))。

圖4 9批樣品在系統(tǒng)A中所得到的色譜圖

圖5 9批樣品在系統(tǒng)B中所得到的色譜圖

從所得數(shù)據(jù)可以看出，9批樣品在兩個(gè)系統(tǒng)中均顯示相近的色譜圖，兩個(gè)系統(tǒng)的差異主要在于分離度和保留時(shí)間，而主要色譜峰的相對保留時(shí)間非常接近。

不同樣品之間，幾個(gè)主要色譜峰的相對峰面積差異較大，如在系統(tǒng) A中的 13號峰(保留時(shí)間 46.8 min，相對保留時(shí)間1.37)，與參比峰的相對峰面積最小值為 0.9，最高值超過 3.3；相應(yīng)的，在系統(tǒng) B中，對應(yīng)的12號峰(保留時(shí)間19.3min，相對保留時(shí)間1.45)也呈現(xiàn)相同的趨勢。根據(jù)文獻(xiàn)[2]所附色譜圖和色譜條件推測，該峰可能系絡(luò)石苷水解后的絡(luò)石苷元。特別的，4份飲片樣品中該峰的相對峰面積在2～3，而5份藥材樣品則均低于1.5。這可能系絡(luò)石藤藥材在炮制過程中，部分絡(luò)石苷會水解轉(zhuǎn)化為絡(luò)石苷元而導(dǎo)致的。

表1 系統(tǒng)A中共有峰的相對保留時(shí)間

表2 系統(tǒng)B中共有峰的相對保留時(shí)間

表3 系統(tǒng)A中共有峰的相對峰面積

表4 系統(tǒng)B中共有峰的相對峰面積

3 討論

在兩種色譜柱上分別建立了針對絡(luò)石藤的指紋圖譜分析方法，采用相同的流動相、不同的梯度洗脫方式，紫外280 nm檢測，所得結(jié)果可以區(qū)分樣品間的差異。

在Eclipse plus C18柱上可以得到更多的共有峰，可以用于絡(luò)石藤藥材指紋圖譜的分析和各化學(xué)成分的含量測定，同時(shí)，分離度也優(yōu)于Chromolith RP－18e柱；但后者的分析時(shí)間只需要20min，考慮到色譜柱平衡的時(shí)間很短，采用整體化色譜柱的分析時(shí)間縮短為顆粒型色譜柱的1／4～1／3，適合于樣品的快速鑒別和短期內(nèi)大量樣品的批量分析。

在10批藥材中，采自廣東的1號藥材異常，體現(xiàn)為色譜圖中只有一個(gè)較小的色譜峰，且未與任何共有峰對應(yīng)，應(yīng)屬經(jīng)過提取的偽品，一些文獻(xiàn)[3－5]中也提到了在不同的地區(qū)，絡(luò)石藤藥材的習(xí)用植物有較大差異。

在之前的研究中，整體柱在甘草和丹參藥材指紋圖譜分析中均具有比顆粒型色譜柱更好的分辨率、在大黃藥材的研究中分離效果與傳統(tǒng)商品柱相當(dāng)，而本次對絡(luò)石藤的結(jié)果恰恰相反。值得注意的是，整體柱取得較好結(jié)果的情形均是在使用乙腈作為有機(jī)相時(shí)出現(xiàn)的；而在絡(luò)石藤和之前大黃藥材的指紋圖譜分析中，有機(jī)相為甲醇。這可能意味著對于整體化色譜柱，由于其物理結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)方式的差異，不同類型的溶劑(是否質(zhì)子化溶劑、介電常數(shù)、黏度)可能具有不同的選擇性。實(shí)際上，在絡(luò)石藤藥材早期的研究中，由于使用乙腈作為有機(jī)相，整體柱的確得到比顆粒型色譜柱更好的分離效果。

在實(shí)際樣品的測定中可以發(fā)現(xiàn)，絡(luò)石苷和推測為絡(luò)石苷元這兩個(gè)色譜峰占總峰面積的近50%，這兩個(gè)峰的相對峰面積差異極大，因而對指紋圖譜的相似性具有重要的影響。雖然4批飲片均為后一個(gè)峰的峰面積是絡(luò)石苷峰的2倍以上、而5批藥材中兩個(gè)峰的峰面積比在1.5倍以下，但考慮到樣品批次較少，仍需要進(jìn)一步的研究以判斷這種差異是否來自于藥材炮制過程中因絡(luò)石苷發(fā)生水解而導(dǎo)致的。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:252－253.

[2]劉義全，于能江，楊學(xué)東，等.絡(luò)石藤高效液相色譜指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志，2009，34(6):727 －730.

[3]章樂建.絡(luò)石藤與薜荔的異同[J].海峽藥學(xué)，2011，23(5)：54－55.

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[5]來平凡，范春雷，李愛平.夾竹桃科絡(luò)石與桑科薜荔抗炎鎮(zhèn)痛作用比較[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，21(1):154 －155.