半持久性病毒的介體傳播機(jī)制研究進(jìn)展

田曉 李玲娣 劉金香

病毒介體有昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)、螨和真菌等，絕大多數(shù)病毒依賴(lài)于昆蟲(chóng)傳播。傳毒昆蟲(chóng)主要集中在同翅目，其中蚜蟲(chóng)傳播植物病毒的能力居病毒媒介昆蟲(chóng)的首位，是最主要的傳毒介體，而葉蟬和飛虱是僅次于蚜蟲(chóng)的最重要的昆蟲(chóng)介體［1］。介體以非持久性方式（nonpersistent transmission）、半持久性方式（semipersistent transmission）和持久性方式（persistent transmission）傳播植物病毒，持久性傳播又分為增殖型傳播（propagative transmission）和非增殖型傳播（nonpropagative transmission）兩種［2，3］。在非持久性傳播中，介體利用口針連續(xù)刺穿植物表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜獲毒，故介體獲毒時(shí)間短暫；在半持久性傳播中，介體獲毒位點(diǎn)一般在韌皮部，需長(zhǎng)時(shí)間穿刺，故介體獲毒時(shí)間在幾分鐘到數(shù)小時(shí)之間；而在持久循環(huán)型傳播和持久增值型傳播中，介體獲毒時(shí)間長(zhǎng)達(dá)幾小時(shí)到幾天。植物病毒與傳播介體的關(guān)系，詳見(jiàn)表1。最近分子生物學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，促進(jìn)了植物病毒介體傳播機(jī)制的研究。國(guó)內(nèi)外已有對(duì)非持久性和持久性傳播機(jī)制的概述，但對(duì)于半持久性傳播機(jī)制的研究比較少，目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)這方面的綜述報(bào)道。本文就半持久性病毒傳播機(jī)制研究進(jìn)展作一概述。

表1 植物病毒與其傳播介體的關(guān)系

1 半持久性病毒的特性

目前發(fā)現(xiàn)的半持久性病毒的種類(lèi)不多，主要屬于長(zhǎng)線形病毒科（Closteroviridae）、花椰菜花葉病毒科（Caulimoviridae）、曲線病毒科（Flexiviridae）和伴生病毒科（Sequiviridae）等（表2），這些科的病毒粒體形態(tài)呈桿菌狀、線狀或等軸球狀，其基因組有單分體和二分體的DNA和RNA。蚜蟲(chóng)以半持久性方式傳播花椰菜花葉病毒（Cauliflowermosaic virus，CaMV）、柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）和甜菜黃化病毒（beet yellows virus，BYV）等；葉蟬以半持久性方式傳播玉米褪綠矮縮病毒（Maize chlorotic dwarf virus，MCDV）、水稻東格魯球狀病毒（Rice tungro spherical virus，RTSV）和水稻東格魯桿狀病毒（Rice tungro badnavirus，RTBV）等；煙粉虱以半持久性方式傳播萵苣侵染性黃化病毒（Lettuce infectious yellows crinivirus，LIYV）和長(zhǎng)線形病毒屬的一些病毒。

2 研究方法

目前研究傳播機(jī)制的方法主要有免疫印跡和血清學(xué)中和試驗(yàn)等，隨著各類(lèi)學(xué)科的全面發(fā)展，各種技術(shù)不斷成熟，同時(shí)也出現(xiàn)了許多新技術(shù)。

2.1 免疫印跡法（immunoblotting）

免疫印跡法是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布最常用的方法。Tian等［5］應(yīng)用免疫印跡法分析LIYV病毒粒子，在病毒粒子的抽提液中檢測(cè)到了外殼蛋 白（capsid protein，CP）、 小 外 殼 蛋 白（minor capsid protein，CPm）、59kD蛋 白（59-kD apparentmolecularmass protein，P59）和熱休克HSP70同源蛋 白（heat shock protein70homologue，HSP70h）。Satyanarayana等［6］合成CPm的多克隆抗體并進(jìn)行免疫印跡分析證實(shí)CTV CPm僅由突變體b（在CTV 5'非翻譯區(qū)第一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的頂端）和突變體e（在CTV 5'非翻譯區(qū)第二個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的底部）構(gòu)成。Drucker等［7］將融合表達(dá)的P2固定在樹(shù)脂上，研究CaMV粒子或P3與P2的相互結(jié)合發(fā)現(xiàn)，只有CaMV和P3同時(shí)存在時(shí)，病毒與P2才可以相結(jié)合，并且CaMV、P3和P2的復(fù)合體可以經(jīng)蚜蟲(chóng)傳播。Peremyslov等［8］在提純病毒 BYV時(shí)發(fā)現(xiàn)，CP在梯度離心的最上層，且HSP70h、64kD蛋白（64-kD protein，P64）、20kD 蛋白（20-kD protein，P20）和CPm在同一密度梯度最亮，并通過(guò)與點(diǎn)突變結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)BYV P20雖是病毒粒子組裝必需的蛋白但對(duì)其他蛋白與病毒粒子的結(jié)合不是必需的。Druka等［9］為了確定從健康植株及感染RTSV植株中萃取的蛋白是否已被純化，利用免疫印跡法進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose-binding protein，MBP）抗體與這些蛋白均無(wú)交叉反應(yīng)，這說(shuō)明純化的蛋白中已不含MBP。

表2 半持久性病毒的特性

2.2 血清學(xué)侵染性中和分析（serological infectivity neutralization analyses）

血清學(xué)侵染性中和分析是根據(jù)抗體能否影響病毒的侵染性而建立的免疫學(xué)試驗(yàn)。Tian等［5］發(fā)現(xiàn)，LIYV CPm抗血清幾乎完全阻滯了LIYV病毒粒子的傳播，推測(cè)CPm在LIYV的粉虱傳播中有至關(guān)重要的作用。Hibino等［10］以薄膜飼喂法為基礎(chǔ)利用血清學(xué)試驗(yàn)探究與水稻東格魯病發(fā)生相關(guān)的病毒。

2.3 免疫金標(biāo)記和電鏡技術(shù)（immunogold labeling and transmission electronmicroscopy，IGL-TEM）

結(jié)合膠體金探針與病原抗原蛋白達(dá)到將病原定位于細(xì)胞的目的，并且靈敏度高、操作步驟簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速。Satyanarayana等［6］通過(guò)標(biāo)記 CTV的CPm抗體發(fā)現(xiàn)，CPm包裹病毒5'端RNA。Khelifa等［11］在低密度病毒內(nèi)含體（electron-lucent viral inclusion bodies，elIBs）中檢測(cè)到CaMV P2和P3，而在高密度病毒內(nèi)含體（electron-dense viral inclusion bodies，edIBs）中只檢測(cè)到CaMV P3，推測(cè)edIBs中可能有P3和病毒粒子復(fù)合體，elIBs可能有P2、P3及病毒粒子復(fù)合體。

2.4 免疫熒光定位（Immunofluorescence technique）

免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。Chen等［12］利用免疫熒光定位技術(shù)發(fā)現(xiàn)，LIYV病毒粒子特異地滯留在煙粉虱的前腸或食竇，且CPm與LIYV病毒粒子的傳播密切相關(guān)。Martinière等［13］用熒光素標(biāo)記的二抗免疫確定CaMV 的P2和P3在感病植株的部位發(fā)現(xiàn)，P2可以和細(xì)胞微管結(jié)合，在P2存在的情況下，P3也可以與細(xì)胞微管結(jié)合，進(jìn)一步表明病毒與寄主細(xì)胞微管的相互作用有助于病毒的介體傳播。

2.5 X射線晶體學(xué)（X-ray crystallography）

X射線晶體學(xué)是將X射線與晶體學(xué)聯(lián)系起來(lái)研究各類(lèi)晶體結(jié)構(gòu)，特別是蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)。Francois等［14］利用X射線晶體學(xué)分析CaMV病毒粒子P3的結(jié)構(gòu)，游離的P3 N端是4個(gè)平行的無(wú)規(guī)則卷曲的四聚體得知未配對(duì)P3 N末端是四聚物平行螺旋，并與獨(dú)特的組織通過(guò)二硫鍵形成反向右手超螺旋。

3 傳毒機(jī)制

3.1 外殼機(jī)制

外殼蛋白參與介體傳播有兩種方式，一種是只有外殼蛋白決定介體的傳播；另一種是介體的傳播需要病毒編碼的蛋白的參與，外殼蛋白與輔助蛋白共同介導(dǎo)介體傳播。只有外殼蛋白決定介體傳播的最初證據(jù)來(lái)自于在沒(méi)有其他蛋白質(zhì)或因子的情況下提純的病毒可以在人工飼喂系統(tǒng)上傳播，純化的LIYV粒體能夠由煙粉虱在體外獲得后以半持久性方式傳播，說(shuō)明LIYV通過(guò)外殼機(jī)制傳播。LIYV是目前發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)不需要輔助成分就可以通過(guò)半持久性方式傳播的病毒［15］。

Tian等［5］應(yīng)用免疫膠體金標(biāo)記分析LIYV病毒粒子發(fā)現(xiàn)，CP覆蓋LIYV基因組的95％，CPm僅出現(xiàn)在病毒粒子的一個(gè)末端，覆蓋基因組的5％。Tian等［5］發(fā)現(xiàn)CPm的抗血清能很大程度地降低傳毒率甚至無(wú)法傳毒。為了進(jìn)一步研究LIYV傳播的決定因素，Stewart等［16］構(gòu)建了LIYV突變體發(fā)現(xiàn)，CPm是LIYV煙粉虱傳播的必需成分。

3.2 輔助機(jī)制

3.2.1 輔助因子 輔助機(jī)制研究地比較清楚的半持久性病毒是CaMV。CaMV的蚜傳非常復(fù)雜，其蚜傳需要的3種成分，包括P2、P3和P4。P2 是CaMV編碼的18-kD非結(jié)構(gòu)蛋白，被稱(chēng)為輔助蛋白，P2的N端與蚜蟲(chóng)口針結(jié)合；P3是CaMV編碼的15-kD蛋白，錨定在CaMV病毒粒子上；P4是CaMV主要外殼蛋白［7］。史曉斌等和 Uzest等［17，18］通過(guò)綠色熒光蛋白標(biāo)記發(fā)現(xiàn)P2 的滯留位于蚜蟲(chóng)口針末端。體外覆蓋試驗(yàn)及活性鑒定表明P3與P2的C端結(jié)合，P3連接P4［19，20］，在某種程度上P3在 P2和 P4間起到橋的作用，CaMV通過(guò)P2連接到蚜蟲(chóng)口針上。Moreno等［21］發(fā)現(xiàn)P2 N端的第六位氨基酸是CaMV蚜傳的決定因素。CaMV感染植物時(shí)，能誘導(dǎo)形成內(nèi)含體，內(nèi)含體中有蚜蟲(chóng)傳毒所需的病毒粒子成分——P2、P3及病毒顆粒。此內(nèi)含體又被稱(chēng)為傳播體（transmission body，TB），對(duì)蚜蟲(chóng)傳毒有重要作用。根據(jù)P3的N端特性推斷，P3構(gòu)象變化起到分子開(kāi)關(guān)的作用。P3處于還原態(tài)后，能結(jié)合內(nèi)含體的P2或其他成分，若P3處于氧化態(tài)，則結(jié)合位點(diǎn)被封閉，TB會(huì)立刻分解，它的組成成分會(huì)分散，從而被蚜蟲(chóng)獲得，并推測(cè)氧化還原態(tài)的改變與蚜蟲(chóng)穿刺植物細(xì)胞引起的活性氧相關(guān)［14，22］。

MCDV也是通過(guò)輔助成分以半持久性方式經(jīng)葉蟬傳播，但對(duì)其傳播機(jī)制的研究很少。Hunt等［23］推測(cè)一種類(lèi)似輔助成分的蛋白存在于MCDV的傳播中，但具體成分還未被鑒定。2004年，Rym等［24］分別抽提在健康植株和感染MCDV-S的植株上取食的葉蟬，并利用MCDV-T、R78、R37和R69的抗體與之進(jìn)行免疫印跡，只有R78與類(lèi)似P25的25kD蛋白反應(yīng)。但在感染MCDV-S的植物抽提液中沒(méi)有檢測(cè)到25kD蛋白（25-kD protein，P25），只檢測(cè)到35kD蛋白（35-kD protein，P35）。但帶毒葉蟬體內(nèi)P35的含量沒(méi)有P25豐富，據(jù)此推斷P25在葉蟬中不斷地累積，而且葉蟬傳毒48h后，體內(nèi)的P25快速消失。推測(cè)P25可能是MCDV的輔助成分。

3.2.2 輔助病毒 水稻東格魯病由分類(lèi)學(xué)上不相關(guān)的兩種病毒引發(fā)，即 RTBV 和 RTSV［25］。Hibino［26］提出水稻同時(shí)感染RTBV和RTSV才能表現(xiàn)癥狀，若只感染RTSV只會(huì)表現(xiàn)輕微萎縮。Hibino［27］發(fā)現(xiàn)RTBV只有在RTSV存在時(shí)才能傳播。葉蟬取食感染RTSV或RTBV的植株后傳毒，只能在受毒植株中檢測(cè)到RTSV而不能檢測(cè)到RTBV。若葉蟬取食感染RTSV的植株再取食感染RTBV的植株后傳毒，則健康植株染?。坏羧~蟬先感染RTBV再感染RTSV后傳毒給健康植株，RTBV仍不能被傳播。然這說(shuō)明RTSV是RTBV的輔助病毒，也為RTBV傳播機(jī)制的研究提供了有用信息。

峨?yún)ⅫS化病毒（Anthriscus yellows virus，AYV）和歐防風(fēng)黃點(diǎn)病毒（Parsnip yellow fleck virus，PYFV）均以半持久性方式經(jīng)蚜蟲(chóng)傳播［20］。Murant等［28］在蚜蟲(chóng)前腸中發(fā)現(xiàn)PYFV及AYV病毒粒子。蚜蟲(chóng)取食感染PYFV或AYV的植株后，在蚜蟲(chóng)體內(nèi)只檢測(cè)到AYV而沒(méi)有檢測(cè)到PYFV；蚜蟲(chóng)先取食感染AYV的植株再應(yīng)用膜飼喂法人為飼喂蚜蟲(chóng)PYFV病毒粒子，則在蚜蟲(chóng)體內(nèi)同時(shí)檢測(cè)到AYV和PYFV；但若蚜蟲(chóng)先取食健康植株再取食PYFV病毒粒子，則在蚜蟲(chóng)體內(nèi)檢測(cè)不到PYFV。這是因?yàn)楦腥玖薃YV的植物可能存在某種輔助成分，這種輔助成分在PYFV的蚜傳中起到關(guān)鍵作用，這表明AYV是PYFV的輔助病毒。

4 展望

侵染植物的病毒的復(fù)雜多樣使得介體傳播機(jī)制各異，目前研究較為深入的是輔助機(jī)制和外殼機(jī)制。病毒的外殼蛋白參與非持久性黃瓜花葉病毒（cucumbermosaic virus，CMV）和持久性雙生病毒科（Geminiviridae）等病毒的傳播［29-31］，非持久性馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）病毒的介體傳播需要輔助蛋白（helper component proteinase，HC-Pro）的參與，馬鈴薯Y病毒屬病毒CP與HC-Pro相互作用［32-34］。除這兩種機(jī)制外，其他的傳播機(jī)制尚不清楚。

半持久性病毒的傳播特性介于非持久性病毒和持久性病毒之間，對(duì)于其傳播機(jī)制的研究相對(duì)較少，只有CaMV和LIYV的傳播機(jī)制研究較深入。很多半持久性病毒的傳播機(jī)制并不清楚，如長(zhǎng)線形屬病毒CTV和BYV。近年來(lái)，學(xué)者們應(yīng)用分子生物學(xué)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR），對(duì)蚜蟲(chóng)體內(nèi)柑桔衰退病毒進(jìn)行了定性定量測(cè)定［35］。雖然對(duì)蚜蟲(chóng)傳播CTV和BYV的分子特征、傳毒特性、傳毒率及影響傳毒率的因素等方面進(jìn)行了研究［36，37］，但對(duì)橘蚜傳播機(jī)制的研究一直沒(méi)有深入進(jìn)展。Albiach-Martí等［38］通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，蚜蟲(chóng)會(huì)選擇性傳播CTV分離株的基因組RNA（genomic RNA，gRNA）變異體及缺陷型 RNA（defective RNA，D-RNA）。Herron等［39］發(fā)現(xiàn)CTV的P20蛋白（20-kD protein，P20）抗體可以極大地提高褐色桔蚜傳播T66IH-3分離株的能力，但大外殼蛋白P25（25-kD protein，P25）、P20蛋白和小外殼蛋白P27（27-kD protein，P27）抗體對(duì)褐色桔蚜在體外傳播CTV3800和T66aH分離株的能力沒(méi)有明顯影響。Barzegar等［40］分析CTV的非蚜傳及蚜傳分離株的P27發(fā)現(xiàn)，第14、238和239位的氨基酸被帶不同電荷和極性的新氨基酸替代，氨基酸的替換可能影響了蚜傳效率。He等［41］發(fā)現(xiàn)，與BYV 21kD蛋白（21-kD protein，P21）的抗血清相比，BYV 24kD蛋白（24-kD protein，P24）和CP的抗血清抑制了蚜蟲(chóng)對(duì)BYV的傳播，這表明P24和CP可能參與BYV的蚜傳。

熒光標(biāo)記及血清學(xué)試驗(yàn)有助于半持久性病毒傳播機(jī)制的研究。根據(jù)不同的傳播機(jī)制，制定行之有效的策略來(lái)阻斷昆蟲(chóng)介體對(duì)植物病毒的傳播。除此之外，病毒、介體和寄主三者相互作用的深入研究，對(duì)于病毒的起源與進(jìn)化和病毒的流行都具有重要的理論和實(shí)際意義。

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