阪崎腸桿菌膠體金試紙條的制備及初步應(yīng)用

周鶴峰 邵敏 李長福 葛正龍

阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii，ES）是一種周生鞭毛、革蘭氏陰性無芽胞桿菌，為條件致病菌，新生兒特別是早產(chǎn)兒和免疫力低下的人作為易感染人群，易導(dǎo)致腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結(jié)腸炎［1］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，阪崎腸桿菌主要通過嬰兒配方奶粉傳播導(dǎo)致感染，死亡率高達(dá)50％以上，F(xiàn)AO/WHO已經(jīng)將其列為A類危險(xiǎn)致病微生物［2］。近年來，阪崎腸桿菌感染事件國內(nèi)外相繼報(bào)道，已引起世界各國重視，其中較多的是嬰兒配方奶粉污染［3］。

目前，阪崎腸桿菌的檢測主要依賴傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)方法、分子生物學(xué)等檢測手段［4］，我國已于2005年頒布了ES分離與計(jì)數(shù)檢驗(yàn)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但上述方法都存在檢測周期長、操作繁瑣等不足，很難在實(shí)際快速檢測中得到廣泛推廣和應(yīng)用。免疫膠體金層析技術(shù)（GICA）具有簡單、快速、準(zhǔn)確、不需貴重儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員操作等優(yōu)點(diǎn)，近年來在多個(gè)領(lǐng)域得到了較廣泛的應(yīng)用，但將膠體金免疫層析試紙條用于阪崎腸桿菌的檢測目前國內(nèi)外未見報(bào)道。本研究利用課題組前期篩選出的雜交瘤細(xì)胞株制備了阪崎腸桿菌單克隆抗體，采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化單克隆抗體，雙抗夾心法制備膠體金試紙條，并進(jìn)行初步檢測試驗(yàn)，旨在為今后開發(fā)商品化的快速檢測試紙條產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）、牛血清白蛋白（BSA）購自美國Sigma公司；檸檬酸三鈉、Tween-20購自上海精析化工科技有限公司；硝酸纖維素（NC）膜購自美國Millipore公司；羊抗鼠IgG（二抗）購自上海生工生物工程有限公司；阪崎腸桿菌（ATCC 51392）購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；阪崎腸桿菌單克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室自制；快速增菌液購自北京陸橋科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 SXCL-3型數(shù)顯加熱磁力攪拌器、超聲儀、漩渦混勻儀WH-3 均購自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；H-600透射電鏡購自日本日立公司；冷凍離心機(jī)購自美國Thermo Electron；D U640 紫外光譜掃描儀購自BECKMAN公司。

1.2 方法

1.2.1 ES單克隆抗體制備及效價(jià)檢測 培養(yǎng)的阪崎腸桿菌離心收集菌體，加1％的甲醛滅活，計(jì)數(shù)，PBS稀釋至2×108CFU/mL作為免疫原，按0.5mL/只菌液量腹腔免疫BALB/c小鼠，待小鼠血清效價(jià)達(dá)到要求后，常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合、篩選及亞克隆，取培養(yǎng)上清與常見的致病菌進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)檢測其特異性。將特異性較強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞株通過小鼠體內(nèi)誘生腹水法制備ES單抗，辛酸-硫酸銨法對(duì)單抗進(jìn)行純化，單克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定抗體的亞型，間接ELISA法檢測其親和力及效價(jià)。

1.2.2 膠體金的制備 利用檸檬酸三鈉法制備40nm膠體金［5］，具體方法：加熱100mL0.01％的氯金酸溶液至沸騰后，迅速用廣口試管加入1％的檸檬酸三鈉溶液1mL，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)煮沸10min，冷卻，4℃保存?zhèn)溆谩＠猛干潆婄R和紫外光譜掃描儀分析膠體金的性狀。

1.2.3 標(biāo)記條件的選擇 標(biāo)記條件包括：最佳標(biāo)記量以及最佳標(biāo)記pH值，二者均利用Mey氏穩(wěn)定性試驗(yàn)確定［6］，具體方法：在酶標(biāo)板孔中分別加入膠體金 100μL，依次加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3和3.5μg的抗阪崎腸桿菌單克隆抗體，混勻10min后各加入10％ NaCl溶液20μL，于10min后肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果，第一個(gè)保持不變顏色孔的抗阪崎腸桿菌單克隆抗體加入量即為最少穩(wěn)定量，最少穩(wěn)定量增加10％左右為實(shí)際標(biāo)記量；取三支1.5mL離心管各裝膠體金1mL，用0.1mol/L HCl和K2CO3分別調(diào)pH為7.2、8.2和9.2，加入最佳標(biāo)記抗體量，對(duì)比標(biāo)記效果。

1.2.4 免疫膠體金制備［7］取10mL膠體金于三角瓶中，用K2CO3調(diào)pH為最佳標(biāo)記條件，加入最佳標(biāo)記抗體量，攪拌反應(yīng)30min，得免疫膠體金，8000r/min離心30min，用1mL PBS復(fù)溶免疫膠體金備用。將制備好的免疫膠體金噴涂在玻璃纖維膜上制成膠體金墊。

1.2.5 層析NC膜的制備 將羊抗鼠二抗（C線）和阪崎腸桿菌單克隆抗體（T線）蛋白分別劃在NC膜上，二者的濃度分別為0.5mg/mL和1mg/mL，制成層析NC膜。

1.2.6 試紙條的組裝及結(jié)果判定 膠體金試紙條由樣品墊、金標(biāo)墊、吸收墊、NC 膜和PVC底板組成，按順序組裝試紙條。取50μL樣品加于試紙條樣品墊上，5min后T線和C線均出現(xiàn)紅色條帶時(shí)為陽性；只有C線顯色為陰性；C線不顯色，無論T線是否顯色，試紙條的檢測結(jié)果無效。

1.2.7 試紙條性能的評(píng)價(jià)

1.2.7.1 試紙條靈敏度的檢測 將濃度為1×106CFU/mL的ES滅活菌懸液用PBS作倍比稀釋，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，每個(gè)稀釋度重復(fù)兩次，并設(shè)PBS為陰性對(duì)照，以檢測到的最低濃度確定為該試紙條的靈敏度。

1.2.7.2 試紙條特異性檢測 分別將滅活的16種菌（表2）用PBS稀釋至1×106CFU/mL，PBS作為陰性對(duì)照，進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，根據(jù)試紙條的檢測結(jié)果判斷其特異性。

1.2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 隨機(jī)抽取3批自制的試紙條檢測3份陽性菌液及陰性對(duì)照菌液，每個(gè)樣品重復(fù)檢測 10 次，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和批間重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.7.4 試紙條穩(wěn)定性試驗(yàn) 試紙條加上干燥劑并用塑料袋密封后分別于4℃和常溫保存，每隔1周取出對(duì)相同陽性與陰性樣本進(jìn)行檢測，觀察其特異性及靈敏度的變化。

2 結(jié)果

2.1 單克隆抗體的鑒定

經(jīng)ELISA篩選共獲得了5株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（1H7、2H9、2B12、4H4和5A5），交叉反應(yīng)結(jié)果顯示1H7和2B12的特異性較強(qiáng)。

采用抗體亞類試劑盒測定，1H7和2B12產(chǎn)生的單抗的抗體Ig亞類分別為IgG1和IgG2a。間接ELISA法測定mAb的相對(duì)親和常數(shù)分別為1.23×109L/mol和 2.68×109L/mol，效價(jià)分別為 1∶1×107和1∶2×107，表明制備的單抗與阪崎腸桿菌的親和力較高。

2.2 膠體金質(zhì)量的鑒定

肉眼觀察所制備的膠體金溶液清澈透明，呈深紅色，利用紫外光譜掃描儀分析膠體金顆粒，由圖1可以看出，膠體金最大吸收波長在538nm，代入回歸方程 y=0.786x+505.53（y：Amax；x：粒徑大小）［8］，可得膠體金溶液的平均粒徑分布在40nm左右。透射電鏡圖顯示膠體金顆粒大小均勻，大部分顆粒呈現(xiàn)圓形，無多角形（圖2）。

圖1 膠體金紫外掃描圖

2.3 標(biāo)記條件的選擇

根據(jù)Mey氏穩(wěn)定性試驗(yàn)，當(dāng)抗體標(biāo)記量為2.5μg/100μL（6號(hào)）時(shí)顏色趨于穩(wěn)定，所以實(shí)際標(biāo)記量為 2.75μg/100μL（圖 3）；在 pH7.2、8.2 和 9.2 三種環(huán)境標(biāo)記的抗體顏色無明顯區(qū)別，而金標(biāo)抗體經(jīng)濃縮在NC膜上與抗原結(jié)合后，pH8.2時(shí)標(biāo)記的顯色較其他兩種明顯（圖4）。

圖2 膠體金顆粒電鏡觀察結(jié)果（20000×）

圖3 抗體最佳標(biāo)記量的確定

圖4 最佳pH值的確定

2.4 組裝試紙條

根據(jù)示意圖流程組裝試紙條（圖5）所示，1為PVC底板，2是將PVC底板的中間的離型紙棄掉，離上邊緣17mm處貼上硝酸纖維（NC）膜，3是將吸水紙壓住NC膜1mm，4中的紅色結(jié)合墊噴涂有免疫膠體金，壓住NC膜1mm，寬度是7mm，5中的最下面貼有樣品墊，壓住結(jié)合墊2mm，檢測時(shí)用于過濾和吸收樣品，6中的幾條膠體金試紙條是5經(jīng)過切條機(jī)切割成的成品膠體金試紙條，整個(gè)膠體金試紙條的長度以及各個(gè)部分的尺寸可以根據(jù)不同的項(xiàng)目調(diào)整，以適用不同的層析條件和速度。

圖5 試紙條組裝流程圖

2.5 試紙條性能檢測結(jié)果

2.5.1 靈敏度檢測結(jié)果 由表1和圖6可看出，5號(hào)和6號(hào)均為陰性，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)為陽性，其中4號(hào)為弱陽性，點(diǎn)樣的菌液濃度為1×104CFU/mL，表明該試紙條對(duì)阪崎腸桿菌的最低檢測濃度為1×104CFU/mL。

表1 試紙條靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

圖6 試紙條的靈敏度

表2 試紙條特異性檢測結(jié)果

3 討論

2.5.2 特異性檢測結(jié)果 應(yīng)用組裝試紙條對(duì)濃度為1×106CFU/mL的16種菌進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果均為陰性（表2），表明該試紙條具有較好的特異性。

2.5.3 試紙條重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 分別用不同批次試紙條檢測，批內(nèi)與批間結(jié)果均無差異，且檢測線和質(zhì)控線條帶清晰，表明試紙條的重復(fù)性良好。

2.5.4 試紙條穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 制備的試紙條在4℃保存6個(gè)月后和常溫保存4個(gè)月后，與新制備的試紙條對(duì)比檢測效果無明顯差異，特異性與敏感性無變化。

膠體金免疫層析技術(shù)因其操作簡單，方便快速，靈敏度高，無需專業(yè)人員和儀器設(shè)備等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯現(xiàn)出越來越廣泛的應(yīng)用前景。

膠體金是指氯金酸在還原劑的作用下還原并聚集形成一定大小的金顆粒，并由于靜電作用而形成穩(wěn)定膠體狀態(tài)，化學(xué)還原法中最常見的還原劑為檸檬酸三鈉［9］。金顆粒的粒徑大小受還原劑用量的影響，試驗(yàn)中摸索還原劑用量，利用檸檬酸三鈉制備膠體金溶液具有可重復(fù)性，制備的膠體金顆粒有利于結(jié)合抗體，同時(shí)有助于自身以及金標(biāo)抗體的穩(wěn)定，適用于膠體金的標(biāo)記，但要制備出質(zhì)量較好的膠體金溶液，較為干凈的器皿也是必不可少的。

標(biāo)記條件是膠體金免疫層析方法最為關(guān)鍵的一步，其中pH值是免疫膠體金形成的關(guān)鍵［10］，在略高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH值的條件下，蛋白質(zhì)能與膠體金表面帶有的正電荷牢固結(jié)合成免疫膠體金；而抗體蛋白的標(biāo)記量決定著整個(gè)成品的靈敏度，由于膠體金結(jié)合抗體蛋白是一定的，如果抗體量少則不能最大可能的逮捕住抗原，導(dǎo)致靈敏度下降；反之抗體多于其飽和標(biāo)記，一則浪費(fèi)抗體，二則游離的抗體會(huì)跟抗原結(jié)合，同樣也會(huì)導(dǎo)致靈敏度下降。

近年來，各種菌體的膠體金檢測試制條相繼出現(xiàn)，但靈敏度并不統(tǒng)一。本試驗(yàn)對(duì)阪崎腸桿菌的最低檢測濃度為1×104CFU/mL，此靈敏度可以滿足日常阪崎腸桿菌的篩選工作，而且檢測方法簡單、時(shí)間短，可以定性的判斷阪崎腸桿菌的含量范圍。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對(duì)pH值和抗體蛋白的標(biāo)記量等條件進(jìn)行摸索，得出40nm膠體金最適蛋白標(biāo)記量為27.5μg/mL，最佳標(biāo)記pH為8.2，膠體金T線包被多抗?jié)舛葹?.5mg/mL，二抗包被濃度為0.625mg/mL。

制備出檢測ES膠體金試紙條，借助于簡單的增菌過程，在6h內(nèi)即可檢測出樣品中是否含有阪崎腸桿菌，檢測下限為1×104CFU/mL；與常見的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、鏈球菌、副溶血性弧菌、志賀氏菌等均無交叉反應(yīng)，該試紙條為ES的檢測提供了一種簡單、靈敏、快速的方式。

［1］ Friedemann M.Epidemiology of invasive neonatal Cronobacter（Enterobacter sakazakii）infections［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2009, 28（11）：1297-1304.

［2］ 梁鷹, 王紅戟.阪崎腸桿菌研究進(jìn)展［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志,2008, 20（4）：418-420.

［3］ Joint FAO/WHO Workshop on Enterobacter sakazakii and Other Microorganisms in Powdered Infant Fomula［R］.Geneva：WHO,2004.

［4］ Derzelle S, Dilasser F, Maladen V, et al.Comparison of three chromogenicmedia and evaluation of twomolecular-based identification systems for the detection of Enterobacter sakazakii from environmental samples from infant formulae factories［J］.J Food Prot, 2007, 70（7）：1678-1684.

［5］ Bassab C, Syamal R.Manufacturinghigh-quality gold sol［J］.IVD Technology, 2001, 8：46-54.

［6］ 白麗榮, 毛占偉, 王慧, 等.氨芐青霉素標(biāo)記的膠體金顆粒的制備及活性研究［J］.生物加工過程, 2008, 6（2）：66-70.

［7］ 姜燕.便潛血單克隆一步法膠體金檢測試卡的研制［J］.生物技術(shù)通報(bào), 2011（5）：236-240.

［8］ 賀昕, 熊曉東, 梁敬博, 等.免疫檢測用納米膠體金的制備及粒徑控制［J］.稀有金屬, 2005, 29（4）：471-474.

［9］ 李志源, 張建斌, 楊百亮.膠體金免疫層析技術(shù)在動(dòng)物疾病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 18（1）：37-41.

［10］ Oliver C, Jamur MC.Immunocytochemicalmethods and protocols［M］.3nd ed.UK：Humano Press, 2010：311-316.