葡萄穗霉木聚糖酶XYA6205在黑曲霉中的表達及酶學(xué)特性分析

王紅霞 王華明 張大龍 羅成

木聚糖是細胞中最具代表性的半纖維素，約占細胞干重的35％，可以作為再生資源被利用［1］。木聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各種酶相互之間協(xié)同完成，起主要作用的是內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶（1，4-β-D-木聚糖酶水解酶，EC3.2.1.8），簡稱木聚糖酶，是當(dāng)前木聚糖酶類的研究熱點。木聚糖酶作用于木聚糖和長鏈木聚糖，從β-1，4-木聚糖主鏈的內(nèi)部切割木糖苷鍵，從而使木聚糖降解為木寡糖，其水解產(chǎn)物主要為木二糖與木二糖以上的寡聚木糖，也有些可以產(chǎn)生少量木糖和阿拉伯糖。

木聚糖酶是涉及半纖維素水解的主要酶，因而具有重要的應(yīng)用價值。研究表明，木聚糖酶在許多工業(yè)中都有廣泛的用途，如食品、動物飼料、制漿造紙、環(huán)境等［2，3］。但是，木聚糖酶要實現(xiàn)有效應(yīng)用，要求其具有良好的酶學(xué)性質(zhì)，在不同領(lǐng)域應(yīng)用要求其具有不同酶學(xué)性質(zhì)［4］。自20世紀(jì)70年代末，80年代初開展木聚糖酶基因的研究工作以來，已有上百種來自真菌和細菌的木聚糖酶基因被克隆并在大腸桿菌中表達［5-10］。

我國對木聚糖酶的研究最近十幾年才開始，基本上還限于天然菌株的篩選、酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)的分析上［11，12］。目前大多是從木霉、黑曲霉中克隆木聚糖酶基因，還沒有葡萄穗霉木聚糖酶基因克隆表達的報道［13-16］。葡萄穗霉具有嗜纖維性，且對于堿性條件也有較好的耐受性［17］。本研究將從葡萄穗霉中克隆得到的木聚糖酶基因xya6205，利用黑曲霉（G1）表達系統(tǒng)實現(xiàn)胞外分泌表達，并對所產(chǎn)重組木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 木聚糖酶基因xya6205為本實驗室保藏的葡萄穗霉中克隆；大腸桿菌菌株E.coli Trans5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；黑曲霉G1為本實驗室保藏。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶SnaBⅠ、XbaⅠ、T4連接酶、Gel Extraction Kit、PCR Kit、PlasmidKit等均購自Fermentas公司；木聚糖酶底物樺木木聚糖（birch wood xylan）購 自 Sigma公 司；KOD-plus購 自TO-YOBO公司；其它生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB、CMC、amds乙酰胺選擇培養(yǎng)基［18］、promosoy specialmedium 產(chǎn)酶培養(yǎng)基、CSL生長培養(yǎng)基均按照常規(guī)實驗室標(biāo)準(zhǔn)配置。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖酶基因xya6205在葡萄穗霉全基因組上的挖掘 通過比較基因組學(xué)，葡萄穗霉全基因組上部分基因功能注釋可能為木聚糖酶，其中13個序列可能為β-內(nèi)切木聚糖酶。為了克隆最有可能的內(nèi)切木聚糖酶基因，采用預(yù)先建立內(nèi)切木聚糖酶基因序列庫，并將相應(yīng)序列分別進行本地BLASTp，同時將這些序列在NCBI進行在線BLASTp。將本地及在線BLAST結(jié)果結(jié)合分析，確定最有可能的內(nèi)切木聚糖酶序列進行克隆。

1.2.2 重組質(zhì)粒pGm-xya6205的構(gòu)建和克隆 根據(jù)挑選的xya6205基因的序列以及表達載體pGm的多克隆位點的特征，設(shè)計引物（表1）由上海Invitrogen公司合成。

表1 克隆xya6205使用的引物

PCR擴增得到的木聚糖酶基因xya6205，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化，用SnaB I和Xba I雙酶切，連接到載體pGm多克隆位點，得到重組質(zhì)粒pGmxya6205。將其向感受態(tài)大腸桿菌Trans 5α中進行轉(zhuǎn)化，30℃倒置過夜培養(yǎng)16h，挑取適中大小的轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證。驗證正確的用加氨芐的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，提取質(zhì)粒。

1.2.3 黑曲霉重組表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定 黑曲霉原生質(zhì)體的制備參照Wernars等的方法操作［19］。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGm-xya6205與100μL原生質(zhì)體混合，并加入12.5μL PEG緩沖液（PEG4000 50％，CaCl20.05mol/L，Tris 1mol/L，pH7.5），冰上靜置20min后再加入1mL上述PEG緩沖液，2mL山梨醇溶液（山梨醇1.2mol/L，CaCl20.05mol/L，Tris 1mol/L，pH7.5），并與融化的AMDS上層培養(yǎng)基混勻，立即平均鋪于3個AMDS 下層培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)5-7d。

挑取轉(zhuǎn)化子到二次驗證板上，同時挑取陽性對照和陰性對照，30℃繼續(xù)培養(yǎng)，若能繼續(xù)生長則為陽性轉(zhuǎn)化子，進行菌絲PCR驗證。菌絲PCR驗證操作過程參見Finnzymes的Phire?plant direct PCR kit操作說明書。驗證正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到斜面上保存，同時保存孢子懸浮液，用甘油管儲存于-80℃冰箱。

1.2.4 重組黑曲霉工程菌株的表達 從斜面上用無菌竹簽挑取孢子，接種到25mL的產(chǎn)酶培養(yǎng)基三角瓶中，搖床培養(yǎng)，30℃，200r/min；3d后取發(fā)酵液，離心，10000r/min，8.5min，取上清 30μL，加入 10μL 4倍上樣buffer（已煮沸），水浴煮沸5min；10000r/min離心1min，待用。

配置SDS-PAGE分離膠和濃縮膠，待凝固后點樣，加入緩沖液，接通電源，首先80 v電壓跑膠，待蛋白樣跑出凝縮膠后改電壓為120 v，直至其跑到最底線；考馬斯亮藍染色 30min；脫色液脫色3次，每次30min，最后用清水浸泡過夜。

1.2.5 重組黑曲霉表達產(chǎn)物酶學(xué)性質(zhì)分析 采用DNS法測定木聚糖酶的活性［20］。酶活定義為：在一定條件下（pH5.5，37℃），每分鐘產(chǎn)生 1μmol木糖所需的酶量為一個酶活力單位（1U）。采用Brandford法測定發(fā)酵液中的蛋白含量。酶活力和酶學(xué)性質(zhì)的測定每組試驗設(shè)3個重復(fù)，取平均值計算。

最適pH的測定：配置不同pH2.7-9.0的緩沖液，在37℃條件下分別測定不同pH值下重組酶的活性。以最高酶活為100％計。

最適溫度的測定：在最適pH條件下，測定不同溫度（30-80℃）下重組酶的活性。以最高酶活為100％計。

酶的耐熱性試驗：重組酶在最適反應(yīng)溫度水浴條件下處理5、10、15、20、25和30min后，在最適反應(yīng)條件下測定殘余酶活，以未處理為100％計。

酶的pH穩(wěn)定性試驗：在室溫（25℃）條件下，將重組酶液在不同pH緩沖液中（pH2.8-8.2）處理18h后，取2mL在酶活測定反應(yīng)體系中測定其殘余酶活，以未處理為100％計。

2 結(jié)果

2.1 黑曲霉重組表達載體的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴增得到了大小正確（1699bp）的xya6205基因（圖1）。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析

挑取5個大腸桿菌菌落進行菌落PCR驗證，其中一個菌落得到了大小正確的xya6205基因（圖2）。將該重組質(zhì)粒pGm-xya6205寄送到博尚生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。測序結(jié)果用DNAMAN軟件與正確序列進行比對，發(fā)現(xiàn)沒有發(fā)生突變，完全正確，重組質(zhì)粒pGm-xya6205構(gòu)建成功。

圖2 菌落PCR鑒定

2.2 黑曲霉的轉(zhuǎn)化

重組質(zhì)粒pGm-xya6205以同源重組的方式進入到黑曲霉GAP3染色體上，因pGm上具有來自構(gòu)巢曲霉的amds基因，可以利用乙酰胺作為唯一氮源，因而試驗中采用amds培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化黑曲霉，可初步方便快捷的篩選出含pGm-xya6205的重組菌株。

篩選后共得到25個陽性轉(zhuǎn)化子。

2.3 重組黑曲霉菌株的PCR快速鑒定

將篩選到的25株轉(zhuǎn)化子，分別進行菌絲PCR快速驗證，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，有18株得到了1699bp的xya6205基因條帶（圖3）。

圖3 黑曲霉轉(zhuǎn)化子菌絲PCR快速鑒定

2.4 重組蛋白的表達

挑取8株菌絲PCR快速驗證呈陽性的轉(zhuǎn)化子及陰性G1進行搖瓶培養(yǎng)，SDS-PAGE（圖4）顯示，有6株在25kD處出現(xiàn)條帶，而陰性無目的條帶。

2.5 重組酶酶學(xué)性質(zhì)的分析

DNS法測得1L發(fā)酵液在第5天時酶活達到最高（392U/mg）。重組酶的最適pH值為5.8，如圖5所示，在pH5.0-9.0范圍內(nèi)酶活均比較高，尤其是在堿性范圍內(nèi)，仍有60％以上的酶活。

圖4 重組木聚糖酶表達的SDS-PAGE

圖5 重組木聚糖酶的最適反應(yīng)pH

重組酶最適溫度為50℃（圖6），在60℃仍有80％酶活，70℃時下降較快，殘余酶活僅為29.9％。

圖6 重組木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度

酶的耐熱性試驗（圖7）表明，重組酶在50℃下保持5min時，殘余酶活還剩80％左右，超過30min酶活僅有23％。另外將重組酶分別在30、40、50、60、70和80℃下金屬浴處理30min后，測定剩余酶活，以未處理的為100％計，在40℃以下酶活性幾乎無損失（圖8）。

圖7 重組木聚糖酶在50℃的熱穩(wěn)定性

圖8 重組木聚糖酶溫度穩(wěn)定性

重組酶的pH穩(wěn)定性如圖9所示，在pH5.2-8.2環(huán)境中處理18h后酶活較穩(wěn)定，存在70％以上的殘余酶活，pH6.8時最高，為83％。

圖9 重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性

3 討論

黑曲霉表達系統(tǒng)是近年來逐漸廣泛使用的新型外源蛋白真核基因表達系統(tǒng)之一。該表達系統(tǒng)具有以下特有優(yōu)點：表達量大；胞外分泌率高；蛋白質(zhì)分子折疊和修飾系統(tǒng)接近高等真核細胞；表達的外源蛋白具有天然活性；良好的安全性［21］。

絲狀真菌葡萄穗霉具有嗜纖維性和嗜堿性，可以在低氮條件下生長，適宜條件下能夠產(chǎn)生多種真菌毒素和其它活性產(chǎn)物。目前還沒有葡萄穗霉木聚糖酶基因克隆表達的報道。本試驗中，將從葡萄穗霉中克隆得到的木聚糖酶基因xya6205（不含自身啟動子）插入到pGm載體的多克隆位點，利用來自于黑曲霉glaA的強啟動子，使目的基因在黑曲霉G1中得到了高效分泌表達。重組木聚糖酶產(chǎn)量達392U/mg，表達產(chǎn)物具有生物活性，為進一步的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了良好的出發(fā)菌株。

該木聚糖酶的最適溫度為50℃，最適pH為5.8。在pH5.0-9.0范圍內(nèi)酶活均比較高，尤其是在堿性范圍內(nèi)，仍有60％以上的酶活，其堿性穩(wěn)定性也較高，在pH8.2環(huán)境中處理18h后，仍有70％殘余酶活。在造紙工業(yè)中，堿性木聚糖酶作為紙漿預(yù)漂白助劑，可以提高紙漿生產(chǎn)能力和紙漿亮度，降低廢水中有機氯含量。重組酶優(yōu)良的堿性穩(wěn)定性為其工業(yè)應(yīng)用的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆、異源表達了具有活性的葡萄穗霉木聚糖酶基因，其粗酶液木聚糖酶比活達392U/mg，最適溫度為50℃，最適pH為5.8，在不同pH緩沖液中處理18h后，最高仍有83％殘余酶活，是一種新型堿性木聚糖酶。

［1］ 邵蔚藍, 薛業(yè)敏.以基因重組技術(shù)開發(fā)木聚糖類半纖維素資源［J］.食品與生物技術(shù), 2002, 21（1）：88-93.

［2］ 顧方媛, 陳朝銀.纖維素酶的研究進展與發(fā)展趨勢［J］.微生物學(xué)雜志, 2008, 28（1）：83-88.

［3］ 劉萌, 戰(zhàn)利, 馬紅霞.纖維素酶及纖維素酶基因工程學(xué)研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39（16）：9515-9517.

［4］ Subramaniyan S, Prema P.Biotechnology ofmicrobial xylanase：enzymology,molecular biology and application［J］.Crit Rev Biotechnol, 2002, 22（1）：33-64.

［5］ Lapidot A, Mechaly A, Shoham Y.Overexpression and single-step purification of a thermostable xylanase from Bacillus stearothermophilus T-6［J］.J of Biotechnology, 1996, 51（3）：259-264.

［6］ Jung KH, Pack MY.Expression of a Clostridium thermocellum xylanase gene in Bacillus subtilis［J］.Biotechnology Letters, 1993,15（2）：115-120.

［7］ Ghangas GS, Hu YJ, et al.Cloning of a Thermomonospora fusca xylanase gene and its expression in Escherichia coli and Streptomyces lividans［J］.J Bacteriol, 1989, 171（6）：2963-2969.

［8］ Herbers K, Wilke I, Sonnewald Μ.A thermostable xylanase from Clostridium thermocellum expressed athigh levels in the apoplast of transgenic tobaccohas no detrimental effects and is easily purified［J］.Biotechnology, 1995, 13：63-66.

［9］ Sun J, Kawazu T, Kimura T, et al.High expression of the xylanase B gene from Clostridium stercorarium in tobacco cells［J］.Fermentation and Bioengineering, 1997, 84（3）：219-223.

［10］ Ludwig A, Boller T.Amethod for the study of fungal growth inhibition by plant proteins［J］.FEMS Microbiology Letters,1990, 69（1-2）：61-66.

［11］ 湯海妹, 曾凡亞, 張義正.Bacillms sp.BT-7木聚糖酶基因的克隆與鑒定［J］.應(yīng)用于環(huán)境生物學(xué)報, 1999, 5（1）：60-63.

［12］ 劉相梅, 祁蒙.木聚糖酶基因克隆、表達與分泌及定點誘變研究進展［J］.生物工程進展, 2001, 21（2）：28-31.

［13］ 何軍, 余冰, 張克英, 陳代文.里氏木霉木聚糖酶基因（XynⅡ）在畢赤酵母中異源表達及重組蛋白酶學(xué)性質(zhì)分析［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2009, 5：920-924.

［14］ 孫建義, 李衛(wèi)芬, 顧賽紅, 許梓榮.黑曲霉木聚糖酶和β-葡聚糖酶cDNA片段克隆和序列分析［J］.浙江大學(xué)學(xué)報, 2001,27（3）.352-354.

［15］ 李偉, 何容, 高志強.黑曲霉耐熱木聚糖酶XYNB在畢赤酵母中的高效表達［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2011, 17（6）：892-896.

［16］ 崔羅生, 祝茂生, 徐順清.黑曲霉木聚糖酶基因（xynA）在大腸桿菌中的表達及酶學(xué)分析［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2009,1（28）：48-53.

［17］ 杜宗軍, 陳冠軍, 高培基.黑色葡萄狀穗霉纖維素酶的純化和性質(zhì)［J］.青島海洋大學(xué)學(xué)報, 2002, 32（1）：79-84.

［18］ 趙穎, 巴再華, 張春艷.雙向選擇標(biāo)記amdS在黑曲霉中自發(fā)突變及amdS-檢測［J］.濟寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2008, 31（4）：283-285.

［19］ Wernars K, Goosen T, Wennekes BM, et al.Cotransformation of Aspergillus nidulans：a tool for replacing fungal genes［J］.Mol Gen Genet, 1987, 209：71-77.

［20］ Ghose TK.Measurement of cellulose activities［J］.Pure and Appl Chem, 1987, 59（2）：257-268.

［21］ 姚婷婷, 王正祥.黑曲霉原生質(zhì)體的制備、再生及轉(zhuǎn)化條件［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2006, 25（4）：116-120.